《食品科學(xué)》：暨南大學(xué)鄭潔副研究員等：食品中柚皮素與丙酮醛形成的加合物及其細(xì)胞毒性評價

丙酮醛（MGO）是一種具有高反應(yīng)活性的

多酚近年來被認(rèn)為是MGO的有效清除劑，在抑制食品中衍生有害物如丙烯酰胺、甲基咪唑、AGEs等，以及阻斷蛋白質(zhì)、DNA、RNA交聯(lián)和糖基化，預(yù)防慢性疾病方面具有極好的前景。柚皮素又稱4’,5,7-三羥基二氫黃酮，主要存在于蕓香科植物葡萄柚、西紅柿及柑橘類植物的果皮和種子中。柚皮素為二氫黃酮類化合物，具有多種生物活性，如降血脂、抑菌消炎、抗氧化、抗癌、抗重金屬毒性等，具備廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的潛力。

暨南大學(xué)生物活性分子與成藥性優(yōu)化全國重點實驗室的吳仲君、暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院的顏婷和鄭潔*等采用模擬體系（37 ℃、pH 7.4）條件，探究柚皮素消除MGO及抑制AGEs生成的效果，通過加合物分離、純化和結(jié)構(gòu)表征，闡釋柚皮素消除MGO的機理，并且在真實食品體系（餅干）中證實加合物的存在，并分析柚皮素添加量對餅干中MGO及柚皮素-MGO加合物形成的影響規(guī)律，最后通過細(xì)胞毒性評價初步評估柚皮素-MGO加合物的安全性，以期為柚皮素等多酚類物質(zhì)應(yīng)用于食品熱加工過程中有害物的控制提供科學(xué)的理論指導(dǎo)。

1 柚皮素對MGO的消除作用

在模擬生理條件下（pH 7.4、37 ℃）測定24 h內(nèi)柚皮素對MGO的消除率，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明隨著反應(yīng)時間延長，柚皮素對MGO的消除率逐漸增加。在反應(yīng)進(jìn)行30 min時，MGO消除率達(dá)到3.27%，1 h后達(dá)到6.80%，而后2 h消除率迅速升高至20.04%，在24 h時，消除率最高，達(dá)到了47.90%。根據(jù)C?mert等的研究，柚皮素屬于具有“慢反應(yīng)、高清除能力”的MGO清除劑，即需要更長的孵育時間才能達(dá)到較好的消除效果。與其他多酚如根皮素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇、槲皮素24 h內(nèi)對MGO的消除率分別為99.7%（k＝23.140 L/（mol·h））、99.4%（k＝12.755 L/（mol·h））、99.1%（k＝9.590 L/（mol·h））、60.5%（k＝0.128 L/（mol·h））、50.0%（k＝0.097 L/（mol·h））相比，柚皮素與MGO的反應(yīng)速率常數(shù)較低（k＝0.015 L/（mol·h）），但在較長的反應(yīng)時間內(nèi)仍有不錯的消除效果。

2 模擬條件下柚皮素對AGEs生成的抑制作用

研究表明MGO可與細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)交聯(lián)形成AGEs，而MGO和AGEs的形成與積累會引起羰基應(yīng)激，誘發(fā)多種慢性及神經(jīng)衰退性疾病，如糖尿病及其并發(fā)癥、阿爾茨海默病等，但活性成分多酚可以通過抗氧化和捕獲MGO的機制有效清除MGO及阻斷AGEs的形成，本研究僅針對后一途徑展開探究。本研究在模擬生理條件下（37 ℃、pH 7.4）測定24 h內(nèi)柚皮素對BSA-MGO體系中熒光AGEs的抑制率，結(jié)果如圖2所示。兩組中AGEs的含量隨時間的延長而增加，且同一時間點空白對照組的AGEs含量高于柚皮素添加組。與空白組相比，在反應(yīng)時間為30 min時，柚皮素的加入對AGEs生成的抑制率是58.8%，隨著反應(yīng)時間延長，抑制率緩慢上升，在反應(yīng)時間達(dá)到24 h時，抑制率升至69.7%。實驗結(jié)果表明，柚皮素有效抑制AGEs的生成，且隨著反應(yīng)時間延長抑制效果逐漸提升，推測是因為柚皮素與體系中的部分MGO互作形成了加合物，從而阻斷了這部分MGO與BSA結(jié)合形成AGEs。

3 加合物的分離純化

柚皮素與MGO反應(yīng)液的HPLC色譜圖如圖3所示，除柚皮素外，還產(chǎn)生了一個新加合物。后期經(jīng)制備液相分離發(fā)現(xiàn)圖3的加合物會分離為兩個峰，如圖4所示，因此將其命名為加合物a和加合物b。

通過HPLC分析發(fā)現(xiàn)，加合物a和加合物b的極性相差不大，因此本研究采用兩步驟法分離純化，即首先采用正相硅膠柱層析富集得到加合物a、b的混合物，再通過中低壓半制備液相分離純化得到純度＞95%的加合物a和加合物b。

4 加合物的結(jié)構(gòu)鑒定

采用HPLC-MS/MS分析發(fā)現(xiàn)兩個加合物的分子質(zhì)量和產(chǎn)生的碎片離子信息基本一致，因此推測兩個物質(zhì)為同分異構(gòu)體，加合物的一級、二級及高分辨質(zhì)譜圖如圖5所示（以加合物a為例）。在負(fù)離子掃描模式下，加合物的分子離子峰為m/z 343（[M－H]－），說明其相對分子質(zhì)量為m/z 344（272＋72），由此推測其可能為一分子柚皮素（相對分子質(zhì)量為272）和一分子MGO（相對分子質(zhì)量為72）加合而成的產(chǎn)物。高分辨質(zhì)譜顯示，加合物的準(zhǔn)確相對分子質(zhì)量為343.080 9，分子式為C18H16O7。進(jìn)一步分析其二級譜可知，加合物的分子離子峰脫去一分子水，在其二級質(zhì)譜中產(chǎn)生了含量很高的m/z 325的碎片，同時m/z 119和m/z 205的碎片離子提示加合物的B環(huán)和C環(huán)發(fā)生了斷裂，MGO應(yīng)該與柚皮素A環(huán)的C6或C8位點發(fā)生了加成反應(yīng)。

對加合物a和加合物b的1H、13C的NMR化學(xué)位移信號進(jìn)行歸屬，結(jié)果如表1所示。NMR結(jié)果顯示，MGO的羰基結(jié)合到柚皮素A環(huán)上的C8位點形成了加合物a和加合物b，并且兩者核磁信號差異不大，說明加合物a與加合物b為空間異構(gòu)體，推測是C11-OH處出現(xiàn)了空間異構(gòu)現(xiàn)象。加合物a和加合物b化學(xué)名均為8-(1-羥基丙酮)-柚皮素。

5 柚皮素強化餅干中MGO和加合物的含量變化

鑒于天然膳食多酚可以有效消除MGO以形成多酚-MGO加合物，但在真實食品體系中研究較少的現(xiàn)狀，本研究將以餅干為研究對象，分析柚皮素添加量對焙烤食品中MGO及柚皮素-MGO加合物形成量的影響規(guī)律。圖6為添加1 g/kg柚皮素制作的餅干樣品的MS譜，其中黑色曲線為總離子流圖，加合物a和b為圖中雙峰，結(jié)果表明在真實的食品體系中有柚皮素-MGO加合物產(chǎn)生。如圖7所示，餅干中MGO的減少量和加合物的生成量均與柚皮素的添加量呈顯著的劑量依賴關(guān)系，隨著柚皮素添加量的增加，MGO的含量逐漸減少，而加合物的生成量逐漸上升。未添加柚皮素的空白組檢測到241 mg/kg MGO，說明MGO在高糖高油的食品中大量產(chǎn)生。當(dāng)柚皮素添加量達(dá)到最大，即1.0 g/kg時，餅干中MGO含量為70 mg/kg，比空白組低70%，同時加合物的含量達(dá)到47.44 mg/kg，該結(jié)果表明焙烤食品中添加柚皮素可以通過與MGO形成加合物的形式有效降低其食品中MGO的含量，且柚皮素添加量越大，降低效果越顯著。

6 MGO、柚皮素、加合物的細(xì)胞毒性評估

鑒于柚皮素消除MGO的機理是發(fā)生親電加成反應(yīng)形成新的加合物，而目前對于這些新發(fā)現(xiàn)的加合物的安全隱患卻鮮有研究。本實驗以柚皮素與MGO作為對照，探究加合物對3 種細(xì)胞系（GES-1、Caco-2、Qsg-7701）的細(xì)胞毒性大小，初步評估加合物的安全性，結(jié)果如圖8所示。柚皮素、MGO和加合物處理的3 種細(xì)胞系的存活率與樣品濃度存在劑量依賴關(guān)系，同一細(xì)胞系同一物質(zhì)處理下，隨著樣品濃度增加，細(xì)胞活力均呈下降趨勢，其中Caco-2細(xì)胞對MGO、柚皮素和加合物表現(xiàn)出的耐受力高于GES-1和Qsg-7701細(xì)胞。

如圖8A所示，對于GES-1細(xì)胞，MGO、柚皮素和加合物處理細(xì)胞24 h后，半數(shù)抑制濃度（IC50）值分別為771.8、381.3 μmol/L和374.5 μmol/L，說明加合物的細(xì)胞毒性比MGO高，與柚皮素相當(dāng)。在加合物處理濃度分別為200、300、400、500 μmol/L時，GES-1細(xì)胞存活率分別為79.5%、51%、40%、35%，繼續(xù)提高處理濃度至600～900 μmol/L時，細(xì)胞存活率基本不變，維持在32%左右，在最大處理濃度1 000 μmol/L時，細(xì)胞存活率降到最低（26.7%）。在低處理濃度范圍（0～500 μmol/L），與加合物相比，柚皮素的細(xì)胞毒性略小，當(dāng)柚皮素處理濃度分別為200、300、400、500 μmol/L時，細(xì)胞活力分別為80%、64%、45%、38%。在高濃度范圍（600～1 000 μmol/L），GES-1對柚皮素更敏感，即加合物的毒性低于柚皮素，其中在處理濃度達(dá)到700 μmol/L時，柚皮素組細(xì)胞活力為18%，而同等處理濃度下加合物組的細(xì)胞活力為33%，在處理濃度高于700 μmol/L時，柚皮素組細(xì)胞活力無顯著變化（P＜0.05），維持在15%左右。

對于Caco-2細(xì)胞（圖8B），結(jié)果顯示加合物的細(xì)胞毒性比MGO高，比柚皮素低。隨著加合物處理濃度上升，細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.05），即處理濃度由200 μmol/L上升至1 000 μmol/L，細(xì)胞存活率由96%下降至64%。對于柚皮素組，處理濃度由200 μmol/L上升至1 000 μmol/L時，細(xì)胞存活率由88%下降至61%，其中在高濃度范圍（600～1 000 μmol/L）時細(xì)胞毒性大小變化不顯著（P＜0.05）。

對于Qsg-7701細(xì)胞（圖8C），MGO、柚皮素和加合物處理細(xì)胞24 h后，IC50值分別為724.9、525.3、601.0 μmol/L，說明加合物的細(xì)胞毒性比MGO高，比柚皮素低，介于兩者之間。隨著加合物處理濃度上升，細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.05），其中處理濃度由200 μmol/L增加至1 000 μmol/L時，細(xì)胞活力由90%下降至21%。當(dāng)柚皮素處理濃度由200 μmol/L增加至1 000 μmol/L時，細(xì)胞存活率由93%下降至20%，其中在最小處理濃度200 μmol/L時，柚皮素組的細(xì)胞存活率高于同濃度處理下的加合物組，繼續(xù)提高處理濃度，柚皮素組的細(xì)胞存活率均低于同濃度處理下的加合物組。

綜上所述，加合物的細(xì)胞毒性高于MGO，比柚皮素低或相當(dāng)。雖然加合物的細(xì)胞毒性高于MGO，但MGO本身屬于低毒物質(zhì)，其主要危害來源于它會在食品加工過程中進(jìn)一步形成衍生有害物，如丙烯酰胺、5-羥甲基糠醛、雜環(huán)胺、甲基咪唑、AGEs等，或經(jīng)人體吸收代謝后修飾蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)形成AGEs，進(jìn)而誘發(fā)一系列慢性疾病。而柚皮素屬于天然膳食多酚類，廣泛存在于柚子、柑橘類植物，富含柚皮素的水果具有廣泛食用安全的歷史，鑒于加合物細(xì)胞毒性不高于天然膳食多酚柚皮素的結(jié)果，提示柚皮素消除MGO形成的加合物安全風(fēng)險低。

結(jié) 論

本研究在模擬生理體系條件（37 ℃、pH 7.4）下，發(fā)現(xiàn)柚皮素對MGO的消除率和AGEs的抑制率均隨時間延長而增加，在24 h時，MGO消除率達(dá)到47.90%，AGEs抑制率達(dá)到69.7%，推測柚皮素與體系中的部分MGO互作形成了加合物，從而阻斷了這部分MGO與BSA結(jié)合形成AGEs。經(jīng)消減產(chǎn)物分離純化及結(jié)構(gòu)表征確定其消除機理為：柚皮素A環(huán)的C8位點與MGO發(fā)生親電加成反應(yīng)而形成加合物。在真實食品體系（餅干）中，柚皮素對MGO的消除率和加合物的形成水平均隨柚皮素添加量的增加而上升，在最大添加量1.0 g/kg時，MGO的消除率為70%，加合物的含量為47.44 mg/kg。鑒于加合物存在于真實食品體系中，并會隨食品攝入體內(nèi)，本研究采用GES-1、Caco2、Qsg-7701 3 種細(xì)胞系評估加合物的細(xì)胞毒性發(fā)現(xiàn)，加合物的細(xì)胞毒性總體不高于膳食多酚柚皮素。上述結(jié)果說明柚皮素可以有效降低MGO和AGEs的形成水平，同時其消除MGO的產(chǎn)物細(xì)胞毒性較低，屬于一種安全高效的MGO清除劑，具有較好的應(yīng)用前景。后續(xù)可針對加合物的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗癌、抑菌能力等，及在體內(nèi)的吸收、代謝及其對健康的長期影響進(jìn)行更深入的研究。

作者簡介

通信作者：

鄭潔，副研究員，博士生導(dǎo)師，廣東省焙烤食品安全粵港聯(lián)合創(chuàng)新平臺副主任，廣東省農(nóng)村科技特派員。入選廣東省“珠江人才計劃”青年拔尖人才、廣東省百名博士博士后創(chuàng)新人物，主要研究領(lǐng)域為熱加工食品安全控制與功能性食品開發(fā)。主持國家自然科學(xué)基金青年及面上項目、芬蘭自然科學(xué)基金國際合作項目等縱向課題10余項；主持橫向課題4 項。發(fā)表論文76 篇，其中SCI論文55 篇（中科院1區(qū)/TOP論文38 篇，ESI高被引2 篇），

H

Frontiers in Nutrition

eFood

Foods

第一作者：

吳仲君，助理實驗師，暨南大學(xué)生物活性分子與成藥性優(yōu)化全國重點實驗室。

教育經(jīng)歷：2017.9-2021.6 暨南大學(xué) 食品質(zhì)量與安全 本科；2021.9-2024.6 暨南大學(xué) 生物與醫(yī)藥 碩士。

研究方向：多酚、氨基酸與活潑羰基化合物的作用機制研究。

科研經(jīng)歷：參與國家自然科學(xué)基金青年基金1 項。

本文《 食品中柚皮素與丙酮醛形成的加合物及其細(xì)胞毒性評價 》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第15期60-66頁，作者： 吳仲君，顏婷，楊曉懷，李紅良，黃才歡，歐仕益，鄭潔 。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250117-129 。點擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關(guān)信息。

實習(xí)編輯：安宏琳；責(zé)任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

為進(jìn)一步促進(jìn)動物源食品科學(xué)理論的完善與創(chuàng)新，加速科研成果向?qū)嶋H生產(chǎn)力的轉(zhuǎn)化，助力產(chǎn)業(yè)實現(xiàn)高質(zhì)量、可持續(xù)發(fā)展，由北京食品科學(xué)研究院、中國肉類食品綜合研究中心、中國食品雜志社將與江西農(nóng)業(yè)大學(xué)、江西科技師范大學(xué)、 南昌師范學(xué)院、 家禽遺傳改良江西省重點實驗室 共同舉辦的“ 2025年動物源食品科學(xué)與人類健康國際研討會 ”，將于 2025年10月25-26日 在 中國 江西 南昌 召開。

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