《食品科學(xué)》：華南理工大學(xué)林偉鋒博士等：ARTP-UV復(fù)合誘變結(jié)合含鹽平板選育產(chǎn)耐鹽高活性蛋白酶的米曲霉

醬油是以大豆/脫脂大豆、小麥/小麥粉和麩皮為主要原料，經(jīng)米曲霉等多種微生物共同發(fā)酵釀制而成的調(diào)味品，具有獨(dú)特的風(fēng)味和色澤并含有豐富的氨基酸。醬油發(fā)酵工藝主要有低鹽固態(tài)發(fā)酵法和高鹽稀態(tài)發(fā)酵法，在高鹽稀態(tài)發(fā)酵法中，18%～21%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）鹽水的加入可以抑制環(huán)境微生物的污染，避免發(fā)酵體系遭受破壞，但是大幅度抑制了蛋白酶的活性，從而降低了原料利用率，延長(zhǎng)了發(fā)酵時(shí)間，選育出一株產(chǎn)耐鹽高活性蛋白酶的菌種將有利于解決該問(wèn)題。

目前主要采用安全性較高的人工誘變方法選育菌種。真菌結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有遺傳多樣性，尤其孢子型霉菌的孢子結(jié)構(gòu)致密，易發(fā)生雜合，這都增加了誘變難度，使得針對(duì)于霉菌的誘變效果比較有限，而ARTP所使用的離子束可以更好地穿透孢子，再結(jié)合傳統(tǒng)的UV誘變進(jìn)行復(fù)合處理，可能會(huì)達(dá)到更好的誘變效果，目前有關(guān)采用ARTP復(fù)合UV誘變米曲霉的報(bào)道較少。

另外，大多數(shù)相關(guān)報(bào)道僅考慮了菌種所產(chǎn)蛋白酶的活性大小，但在實(shí)際發(fā)酵過(guò)程由于高濃度鹽分的影響，使得發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶的活性差異降低。

華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院的孫思城、李浩然、林偉鋒*等研究采用高鹽含量的培養(yǎng)平板馴化誘變后的米曲霉，并采用高鹽含量的鑒定平板評(píng)估菌株所產(chǎn)蛋白酶的耐鹽性，旨在通過(guò)誘變提高菌株蛋白酶活性的同時(shí)提高其耐鹽性。

1 致死率曲線

誘變因子引起菌種發(fā)生基因突變或染色體畸變，一定程度導(dǎo)致菌種的死亡，存活的菌種其基因和性狀發(fā)生改變。菌株致死率與誘變劑量一般呈正相關(guān)，致死率過(guò)低則突變菌株占比低，不利于篩選，菌株致死率過(guò)高則導(dǎo)致突變菌株絕對(duì)個(gè)數(shù)少，同樣不利于篩選，本研究選擇致死率在80%～90%的誘變劑量。由圖2可知，對(duì)K9進(jìn)行ARTP誘變，在誘變0～60 s期間，致死率迅速上升，60～120 s期間放緩，而后進(jìn)入穩(wěn)定階段；對(duì)由ARTP誘變得到的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行UV誘變，在0～60 s期間，致死率迅速上升，60～150 s期間放緩，而后進(jìn)入穩(wěn)定階段。致死率過(guò)高和過(guò)低均不利于篩選，本研究選擇90 s作為ARTP誘變時(shí)間，此時(shí)致死率為88.54%，選擇60 s作為UV誘變時(shí)間，此時(shí)致死率為83%。

2 突變菌株的篩選

2.1ARTP誘變突變菌株的篩選

通過(guò)改良型虎紅培養(yǎng)基分離得到350 株突變株，測(cè)量菌落直徑與透明圈直徑，按照1.3.2.1節(jié)計(jì)算K值、M值和F值，統(tǒng)計(jì)F值大于3%的突變株，共15 株符合條件的優(yōu)勢(shì)菌株，將其統(tǒng)計(jì)于表1中。

將表1中的菌株及K9進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，將發(fā)酵液滴到改良型瓊脂培養(yǎng)基平板上，保溫后測(cè)定透明圈并計(jì)算Z值。由表2可知，共有10 株菌株的Z值高于K9，其中S-G27的Z值最高，為16.3%。

從表2選擇Z值較高的菌株S-B7、S-C4、S-F1、S-F10、S-G27進(jìn)行種曲發(fā)酵，測(cè)定種曲蛋白酶活性與孢子數(shù)，并與K9對(duì)比。由表3可知，菌株的酸性蛋白酶活性均遠(yuǎn)低于中性蛋白酶，可見酸性蛋白酶在米曲霉整個(gè)蛋白酶系中的自身相對(duì)表達(dá)量較低，S-G27表現(xiàn)出最高的蛋白酶活性，其中性蛋白酶活性比K9高出35.82%，酸性蛋白酶活性比K9高出164.02%，且在表2中其透明圈直徑也最大，說(shuō)明S-G27經(jīng)過(guò)誘變后蛋白酶活性明顯提高，且蛋白酶可能具備一定的耐鹽性。

2.2UV誘變突變菌株的篩選

對(duì)ARTP誘變得到的優(yōu)勢(shì)菌株S-G27進(jìn)行UV誘變，共分離得到320 株突變株，計(jì)算其F值，統(tǒng)計(jì)F值大于2.5%的突變株，共12 株符合條件的優(yōu)勢(shì)菌株，將其統(tǒng)計(jì)于表4中。

將表4中的12 株優(yōu)勢(shì)菌株液態(tài)發(fā)酵后，通過(guò)改良型瓊脂培養(yǎng)基平板檢測(cè)其蛋白酶活性，并計(jì)算Z值。由表5可知，共有9 株菌株的Z值高于出發(fā)菌株S-G27，其中G-U2的Z值最高，為13.6%。選擇Z值較高的G-U1、G-U2、G-U10、G-U12、G-U27、G-U29、G-U32菌株進(jìn)行下一步篩選。

對(duì)G-U1、G-U2、G-U10、G-U12、G-U27、G-U29、G-U32進(jìn)行種曲發(fā)酵，測(cè)定種曲蛋白酶活性與孢子數(shù)，并與S-G27和K9對(duì)比，由表6可知，G-U10表現(xiàn)出最高的中性蛋白酶活性，分別比S-G27和K9高21.13%、58.96%；G-U10酸性蛋白酶活性比K9高91%，但略低于S-G27。蛋白酶活性第2高的是G-U2，其中性蛋白酶活性分別比S-G27和K9高19.49%和56.81%，酸性蛋白酶活性分別比S-G27和K9高5.5%和128%。G-U2產(chǎn)孢子數(shù)明顯提高，分別比S-G27和K9高27%和39%，故選擇綜合指標(biāo)較優(yōu)的菌株G-U2和G-U10進(jìn)行下一步研究。

3 突變菌株遺傳穩(wěn)定性曲線的測(cè)定

誘變得到的菌株其產(chǎn)酶基因可能不穩(wěn)定，在傳代的過(guò)程中容易發(fā)生變異，這可能導(dǎo)致菌株優(yōu)良性狀的衰退，從而影響生產(chǎn)穩(wěn)定性。由圖3可知，G-U2產(chǎn)酶更加穩(wěn)定，第7代時(shí)，G-U2的酸性蛋白酶保留活性為91%，G-U10的酸性蛋白酶保留活性為83%；G-U2的中性蛋白酶保留活性為92%，G-U10的中性蛋白酶保留活性為81%，且從第2代開始G-U2的中性蛋白酶活性穩(wěn)定高于G-U10。綜合考慮，選擇穩(wěn)定性更好的G-U2進(jìn)行下一步的研究。

4 不同食鹽含量對(duì)蛋白酶活性的影響

以往研究表明，蛋白酶對(duì)NaCl的耐受能力與蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)、活性中心與催化中心結(jié)構(gòu)、酸性殘基、內(nèi)部殘基疏水性等因素有關(guān)，誘變可能導(dǎo)致有關(guān)結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，從而改變表達(dá)出的蛋白酶結(jié)構(gòu)，且本研究利用鹽平板進(jìn)行培養(yǎng)篩選，所以突變菌株所產(chǎn)蛋白酶可能具備耐鹽性。米曲霉產(chǎn)生的中性蛋白酶量遠(yuǎn)大于酸性蛋白酶，且前期主要是中性蛋白酶發(fā)揮作用，故只分析中性蛋白酶。

由圖4可知，隨著NaCl含量增加，菌株蛋白酶活性均不同程度下降，這與Klomklao等得出的結(jié)果相符。在0%～6% NaCl之間，G-U2蛋白酶活性下降速度慢于K9，后均快速下降，而在整個(gè)過(guò)程中G-U2蛋白酶活性始終顯著大于K9，15% NaCl時(shí)，G-U2與K9蛋白酶殘留率分別為29.45%和12.84%，G-U2為K9的1.94 倍，由此可見G-U2蛋白酶活性受NaCl影響更小，陳之瑤等對(duì)比了不同米曲霉產(chǎn)蛋白酶耐鹽性，其最優(yōu)米曲霉j2所產(chǎn)蛋白酶在15% NaCl環(huán)境中蛋白酶活性殘留率為16.05%，可知本研究選育得到的菌種G-U2優(yōu)于j2。本研究中對(duì)具有一定耐鹽基礎(chǔ)的K9進(jìn)行誘變，又通過(guò)高鹽含量平板多次培養(yǎng)和篩選得到G-U2，不僅其蛋白酶活性得到顯著提高，其蛋白酶耐鹽性也得到一定的提高，這為后續(xù)在高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

5 突變菌株與出發(fā)菌株形態(tài)對(duì)比

誘變因子可以使菌株發(fā)生基因突變，從而導(dǎo)致一系列表觀性狀的改變，不同的性狀改變之間可能存在聯(lián)系。將菌株在培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，由圖5A可知，G-U2的孢子多而密，K9的孢子較稀疏且分布不均；從菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)看，K9的菌絲更長(zhǎng)，菌落中間形成絨毛狀的直立菌絲，而G-U2的菌絲較短；從孢子顏色看，G-U2孢子偏綠，而K9孢子偏黃，上述區(qū)別可能是因?yàn)檎T變改變了與孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)和孢子色素產(chǎn)生的有關(guān)基因，Veerana等的研究表明，采用氮?dú)庾鳛榻橘|(zhì)進(jìn)行等離子體處理米曲霉KACC47488菌株的孢子可以促進(jìn)孢子的萌發(fā)并激活絲裂原活化蛋白激酶，增強(qiáng)了相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，而ARTP正是采用氮?dú)庾鳛榉烹娊橘|(zhì)，可能造成了相似的影響。通過(guò)顯微鏡觀察菌株的菌體結(jié)構(gòu)，由圖5B可知，G-U2孢子頭多而密，但菌絲較短，K9孢子頭稀疏而菌絲較長(zhǎng)，這與圖5A中的菌落特征對(duì)應(yīng)，且與司曉光利用ARTP誘變米曲霉后的形態(tài)變化結(jié)果相似，說(shuō)明突變株G-U2菌絲生長(zhǎng)能力不如K9，但產(chǎn)孢子能力優(yōu)于K9，這與表6中的孢子測(cè)定結(jié)果一致。蛋白酶由菌絲與孢子分泌，而米曲霉作為孢子型真菌，其孢子豐度遠(yuǎn)大于菌絲，說(shuō)明蛋白酶分泌可能主要與孢子有關(guān)，故本研究中G-U2蛋白酶產(chǎn)量?jī)?yōu)于K9的現(xiàn)象可能與G-U產(chǎn)孢子更多有關(guān)。而蛋白酶耐鹽性應(yīng)主要與蛋白酶自身結(jié)構(gòu)有關(guān)，且鮮有相關(guān)報(bào)告表明菌株形態(tài)與其產(chǎn)蛋白酶耐鹽性之間的關(guān)系。

借助掃描電鏡進(jìn)一步觀察孢子個(gè)體的結(jié)構(gòu)，由圖5C掃描電鏡下孢子特征可知，相比于K9的孢子，G-U2孢子體積更大，且中間較為凹陷，形狀接近于橢球形，與孟廣超的研究結(jié)果一致，這可能是ARTP通過(guò)產(chǎn)生活性粒子刺激孢子溶脹所導(dǎo)致，孢子表面突起為孢子表面紋飾，為孢子壁外部結(jié)構(gòu)，可見G-U2經(jīng)誘變后其孢子表面紋飾增加，孢子結(jié)構(gòu)改變可能會(huì)影響菌株萌發(fā)及分泌胞外蛋白酶的能力，例如Ryebenkov等發(fā)現(xiàn)，常壓等離子體處理后的細(xì)胞，其細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，并且該變化非致死可恢復(fù)，這也是與菌株蛋白酶產(chǎn)量變化關(guān)聯(lián)的因素之一。

6 突變菌株安全性檢驗(yàn)

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等某些菌株產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類毒素，其衍生物有約20 種，其中以黃曲霉毒素B1的毒性最大、致癌性最強(qiáng)，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將黃曲霉毒素列入1類致癌物清單中。目前普遍認(rèn)為，米曲霉是由黃曲霉馴化得來(lái)，目前分離到的米曲霉菌株均不產(chǎn)生黃曲霉毒素，但聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和測(cè)序結(jié)果顯示，很多米曲霉菌株實(shí)際上也含有負(fù)責(zé)合成黃曲霉毒素的基因簇，只不過(guò)這些基因發(fā)生了不同形式的序列突變，在本研究中對(duì)米曲霉進(jìn)行了誘變，這有可能激活米曲霉?jié)撛诤铣啥舅氐幕颍视斜匾M(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。

在醬油發(fā)酵生產(chǎn)中，醬油曲發(fā)酵為代謝物質(zhì)富集階段，若菌種在該階段產(chǎn)生黃曲霉毒素將會(huì)直接影響成品醬油安全性，本研究模擬醬油曲實(shí)際發(fā)酵過(guò)程，利用G-U2進(jìn)行小試制曲，采用同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)醬油曲中的黃曲霉毒素G1、G2、B1和B2含量，若計(jì)算結(jié)果小于定量限和檢出限，則符合“未檢出”標(biāo)準(zhǔn)，由表7結(jié)果可知，以G-U2制備的3 次醬油曲作為平行樣進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均達(dá)到“未檢出”標(biāo)準(zhǔn)，初步說(shuō)明G-U2符合生產(chǎn)安全要求。

7 模擬醬油發(fā)酵驗(yàn)證菌株性能

通過(guò)測(cè)定模擬發(fā)酵醬油指標(biāo)，可以進(jìn)一步驗(yàn)證菌株G-U2在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力。由圖6a、b可知，發(fā)酵0 d時(shí)，蛋白酶未被完全釋放，活性較低；發(fā)酵0～1 d，蛋白酶逐漸釋放并溶解于醪液中，蛋白酶活性迅速升高至峰值；隨后由于鹽分、溫度和pH值等因素的影響，蛋白酶活性逐漸降低，值得注意的是，中性蛋白酶活性持續(xù)下降，而酸性蛋白酶活性在發(fā)酵6～8 d略有上升，這可能是由于后期醬醪pH值偏酸，酸性蛋白酶活性得以更好保留，同時(shí)微生物也在緩慢持續(xù)產(chǎn)生酸性蛋白酶。

由圖6a可知，發(fā)酵1 d時(shí)，G-U2醬醪中性蛋白酶活性為266.10 U/mL，K9為172.04 U/mL，G-U2比K9高54.67%；發(fā)酵8 d時(shí)，G-U2醬醪中性蛋白酶活性為80.95 U/mL，K9為36.60 U/mL，G-U2比K9高120.19%；與發(fā)酵1 d相比，發(fā)酵8 d時(shí)G-U2與K9醬醪中性蛋白酶活性殘留率分別為30.29%和21.27%。由圖6b可知，發(fā)酵1 d時(shí)，G-U2醬醪酸性蛋白酶活性為178.97 U/mL，K9為156.20 U/mL，G-U2比K9高14.58%；發(fā)酵8 d時(shí)，G-U2醬醪酸性蛋白酶活性為105.72 U/mL，K9為69.42 U/mL，G-U2比K9高52.29%；與發(fā)酵1 d相比，發(fā)酵8 d時(shí)G-U2與K9醬醪酸性蛋白酶活性殘留率分別為59.07%和44.44%。G-U2醬醪的峰值蛋白酶活性、發(fā)酵終點(diǎn)蛋白酶活性及殘留率均顯著高于K9，表明G-U2產(chǎn)耐鹽高活性蛋白酶的優(yōu)勢(shì)在模擬發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中同樣顯著。氨基酸態(tài)氮含量是評(píng)估醬油質(zhì)量的重要指標(biāo)。由圖6c可知，發(fā)酵0～1 d，氨基酸態(tài)氮含量快速升高，發(fā)酵1～3 d，氨基酸態(tài)氮含量緩慢升高并趨于穩(wěn)定。發(fā)酵至8 d，G-U2醬醪氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度為0.58 g/100 mL，K9醬醪氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度為0.49 g/100 mL，G-U2比K9高18.37%。

上述結(jié)果表明菌株G-U2模擬發(fā)酵醬油綜合指標(biāo)顯著優(yōu)于K9，這表明G-U2具有巨大應(yīng)用潛力，但是實(shí)際生產(chǎn)與模擬實(shí)驗(yàn)仍具有較大不同，后續(xù)可考慮將其應(yīng)用至高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵生產(chǎn)中，以驗(yàn)證實(shí)際應(yīng)用效果。

結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)具有一定耐鹽基礎(chǔ)的A. oryzae K9進(jìn)行誘變，并利用鹽平板進(jìn)行馴化和篩選。先對(duì)其進(jìn)行了ARTP誘變，得到優(yōu)勢(shì)菌株S-G27，其中性蛋白酶活性比K9高35.82%；再對(duì)S-G27進(jìn)行UV誘變，篩選得到優(yōu)勢(shì)菌株G-U2，其中性蛋白酶活性比K9高56.81%。此外，G-U2所產(chǎn)蛋白酶耐鹽性進(jìn)一步提高，在15% NaCl溶液中，G-U2與K9所產(chǎn)蛋白酶活性殘留率分別為29.45%和12.84%；G-U2產(chǎn)孢子較多、穩(wěn)定性良好、不產(chǎn)毒素，符合生產(chǎn)基本要求；誘變還改變了菌種的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，相比于K9，G-U2的菌絲更短、孢子更多、孢子體積更大且表面紋飾更多，這可能也會(huì)影響菌株蛋白酶產(chǎn)量的變化。在模擬發(fā)酵醬油實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵終點(diǎn)G-U2中性蛋白酶活性、酸性蛋白酶活性、氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度分別較K9高120.19%、52.29%、18.37%，表明菌株G-U2具有一定應(yīng)用潛力。本研究利用高鹽含量的培養(yǎng)平板馴化700余株突變菌株，再通過(guò)高鹽含量的鑒定平板評(píng)估菌株耐鹽性，并巧妙地利用香菇培養(yǎng)基富集蛋白酶，通過(guò)打孔平板直接評(píng)估蛋白酶液的耐鹽性，得到菌株所產(chǎn)的蛋白酶具備顯著耐鹽性，可將本研究得到的突變種G-U2可進(jìn)行大規(guī)模投產(chǎn)實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證其實(shí)際應(yīng)用效果，后續(xù)可進(jìn)一步研究菌株的誘變機(jī)制和蛋白酶耐鹽機(jī)制，為定點(diǎn)突變提供參考，從而提高選育效率。

作者簡(jiǎn)介

通信作者：

林偉鋒，男，博士，華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，講師，碩士生導(dǎo)師。

基本信息：1970年2月出生，廣東東莞人。

教育背景：1988年9月至1992年6月在華南理工大學(xué)食品工程系獲學(xué)士學(xué)位；1994年9月至1997年3月在華南理工大學(xué)輕工食品學(xué)院獲碩士學(xué)位，導(dǎo)師為彭志英教授；2000年9月至2003年8月在華南理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院獲博士學(xué)位，導(dǎo)師為彭志英教授。

工作經(jīng)歷：1997年3月至2000年8月在廣州市輕工研究所擔(dān)任技術(shù)員、工程師；2003年9月至今在華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院任講師。

研究領(lǐng)域：主要從事乳類、植物蛋白加工、食品生物技術(shù)、農(nóng)產(chǎn)品加工等方面的研究。

科研項(xiàng)目：近幾年來(lái)主持或參與了廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目4項(xiàng)，國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目3項(xiàng)，農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)1項(xiàng)，企業(yè)資助橫向項(xiàng)目8項(xiàng)。

學(xué)術(shù)成果：發(fā)表學(xué)術(shù)論文30多篇。

第一作者：

孫思城，男，碩士，華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院。

基本信息：1999年11月出生，山東臨沂人。

教育背景：2018年9月至2022年6月在煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院獲學(xué)士學(xué)位；2022年9月至2025年6月在華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院獲碩士學(xué)位。

研究領(lǐng)域：食品生物技術(shù)。

本文《ARTP-UV 復(fù)合誘變結(jié)合含鹽平板選育產(chǎn)耐鹽高活性蛋白酶的米曲霉》來(lái)源于《食品科學(xué)》2025年46卷第15期120 -127 頁(yè)，作者： 孫思城，李浩然，蘇國(guó)萬(wàn)，吳惠貞，林偉鋒* 。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250224-111. http://www.spkx.net.cn 點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：申婧婧；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來(lái)源于文章原文及攝圖網(wǎng)。