《食品科學(xué)》：安徽工程大學(xué)李松副教授等：土曲霉阿魏酸酯酶異源表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)及在阿魏酸制備中的應(yīng)用

阿魏酸酯酶（FAE）又稱肉桂酸酯酶，是羧酸酯酶的一個(gè)亞類，是微生物細(xì)胞壁降解酶庫中的一類酶，能夠水解植物細(xì)胞壁中由阿魏酸（FA）、p-香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸與半纖維素和木質(zhì)素形成的酯鍵，在纖維素水解酶的協(xié)同作用下不僅可以高效降解木質(zhì)纖維素，還可以釋放具有生理活性的酚酸類抗氧化物質(zhì)，在食品、醫(yī)藥、生物質(zhì)燃料、飼料以及造紙等行業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前自然界發(fā)現(xiàn)的FAE主要來源于微生物，分為真菌FAE和細(xì)菌FAE兩種。利用發(fā)酵法制備FAE，一般有液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵方式兩種，可以使用麩皮、燕麥木聚糖和甜菜渣等廉價(jià)原料，但發(fā)酵單位一般較低，通常在1 U/mL以下。因此，利用蛋白重組技術(shù)是目前實(shí)現(xiàn)FAE高效表達(dá)制備的有效途徑之一。

安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院的韓紅祥、郭成城、李松*研究以前期工作中篩選獲得的一株產(chǎn)FAE的土曲霉為出發(fā)菌株，利用分子克隆技術(shù)獲得了該菌種的FAE編碼基因并在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，同時(shí)對(duì)重組酶酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用進(jìn)行研究，以期為FAE的高效表達(dá)及FA的酶法制備提供技術(shù)參考。

1 土曲霉FAE（AtFAE）聚類分析

測(cè)序結(jié)果表明，AtFAE編碼基因長(zhǎng)846 bp，共編碼281 個(gè)氨基酸殘基，其N端前21 個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽序列；成熟肽含有260 個(gè)氨基酸殘基，等電點(diǎn)為4.38，利用軟件NetNGlyc 1.0分析發(fā)現(xiàn)其內(nèi)部含有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（第79位氨基酸殘基）。通過在線數(shù)據(jù)庫Blast/blastp（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）對(duì)AtFAE完整序列（包含信號(hào)肽）進(jìn)行比對(duì)，選擇同源性較高的序列進(jìn)行ClustalW多重比對(duì)（重復(fù)計(jì)算1 000 次），并進(jìn)一步使用MEGA 6.0軟件通過Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)AtFAE與黑曲霉（

A. niger

）、宇佐美曲霉（

A. usamii

）和百歲蘭曲霉（

A. welwitschiae

）等曲霉屬來源的A型FAE聚為一類（相似度＞96%），其次與產(chǎn)黃青霉（

P. chrysogenum

）、亞冬凌青霉（

P. subrubescens

）、齒孢青霉（

P. daleae

）等青霉屬來源的A型FAE也具有較高的相似率（相似度＞75%）。此外，通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)AtFAE與米曲霉（

A. oryzae

）、同心青霉（

P. concentricum

）、嗜糞青霉（

P. fimorum

）等來源的脂肪酶3具有較高的相似度（＞80%）。因此，根據(jù)上述與A型FAE和脂肪酶具有高度相似的序列比對(duì)結(jié)果，可以將AtFAE歸類為A型FAE。

2 重組表達(dá)載體pPIC9K-

Atfae

及重組畢赤酵母的構(gòu)建

利用雙酶切法將土曲霉FAE編碼基因（

Atfae

）連接入pPIC9K質(zhì)粒的

Eco

RI和

Not

I位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-

rAtfae

，如圖2A所示。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無誤后，將重組質(zhì)粒pPIC9K-

rAtfae

導(dǎo)入畢赤酵母中得到重組菌GS115/

rAtFAE

，重組菌點(diǎn)種MM篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后出現(xiàn)明顯的透明圈，如圖2B所示，表明在重組畢赤酵母中成功利用

-Factor信號(hào)肽獲得了rAtFAE的胞外分泌表達(dá)。

3 rAtFAE發(fā)酵制備及純化

重組菌GS115/rAtFAE經(jīng)15 L發(fā)酵罐發(fā)酵72 h結(jié)束，rAtFAE粗蛋白表達(dá)量為（17.38±0.34）U/mL，約為初始菌株的35 倍。發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀、HisTrap HP等步驟純化后，比酶活力和純化倍數(shù)比粗酶液分別提高了約1 倍，如表1所示。經(jīng)SDS-PAGE檢驗(yàn)，rAtFAE分子質(zhì)量約為39 kDa（圖3），約比基于氨基酸序列預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量（29 kDa）大10 kDa，可能是由糖基化修飾所致。

4 rAtFAE酶學(xué)性質(zhì)

4.1 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

最適反應(yīng)溫度測(cè)定結(jié)果顯示，rAtFAE的相對(duì)酶活力在50 ℃時(shí)最高。當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，酶活力急劇下降，在35～50 ℃內(nèi)具有較高的催化活力，約保留了80%以上的催化活性，如圖4A所示。溫度穩(wěn)定性研究表明，rAtFAE在40～50 ℃具有良好的熱穩(wěn)定性，經(jīng)過3 h保溫之后，酶活力仍保留了80%以上，但當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，其熱穩(wěn)定性則急劇下降，在70 ℃保溫2.5 h之后酶完全失活，如圖4B所示。其中，將55 ℃的酶活力與時(shí)間帶入公式

t

1/2 ＝ln 2/

k

可以得到rAtFAE在該條件下的半衰期為57.83 min。

4.2 最適pH值及pH值穩(wěn)定性

測(cè)定結(jié)果表明rAtFAE在pH 4.5～6.0范圍內(nèi)催化活力較高，最適pH值為6.0，而當(dāng)?shù)陀?.5或高于6.0時(shí)rAtFAE的催化活性急劇下降，例如當(dāng)pH值為4.0和7.5時(shí)酶活力僅約為最高活力的25%和10%，如圖5A所示。pH值穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示rAtFAE在pH 5.5～6.5范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，在50 ℃保溫3 h后殘留酶活力在55%以上；當(dāng)pH值低于5.0時(shí)殘留酶活力急劇下降，表明該酶酸性條件下穩(wěn)定性較差，如圖5B所示。

4.3 金屬離子對(duì)酶活力的影響

金屬離子（終濃度2.5 mmol/L）對(duì)rAtFAE活力的影響如表2所示。與對(duì)照組相比，Ca2+和Mn2+對(duì)該酶具有顯著的抑制作用，F(xiàn)e2+對(duì)該酶具有顯著的促進(jìn)作用，李夏蘭等在研究橘青霉FAE時(shí)也發(fā)現(xiàn)了相似實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，即Fe2+（2.5 mmol/L）對(duì)橘青霉FAE具有一定的促進(jìn)作用（相對(duì)酶活力為118%）。除此之外，Cu2+對(duì)酶活力也有顯著影響，而其他所測(cè)試的二價(jià)或一價(jià)鹽離子對(duì)rAtFAE活力沒有顯著影響。

4.4 表面活性劑對(duì)酶活力的影響

3 種常用表面活性劑對(duì)rAtFAE酶活力影響如表3所示，低濃度的EDTA（2.5～5 mmol/L）對(duì)rAtFAE酶活力具有促進(jìn)作用，而高濃度的EDTA（10 mmol/L）則對(duì)rAtFAE活力具有顯著的抑制作用，王丹等在研究小麥來源的FAE時(shí)，也發(fā)現(xiàn)低濃度EDTA（2 mmol/L）對(duì)FAE活力具有促進(jìn)作用（相對(duì)酶活力為115%）；Tween-80對(duì)rAtFAE具有抑制作用，且Tween-80濃度越高，對(duì)酶活力的抑制作用越強(qiáng)；與Tween-80相似，Triton X-100對(duì)rAtFAE活力也具有強(qiáng)烈的抑制作用，且Triton X-100濃度越高，對(duì)酶活力的抑制作用越強(qiáng)。

5 米氏常數(shù)

采用雙倒數(shù)做圖法，分別使用4 種不同底物測(cè)定并計(jì)算rAtFAE的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如表4所示。結(jié)果表明，rAtFAE作用4 種不同底物后均可釋放FA，且當(dāng)使用MSA為底物時(shí)表現(xiàn)出的比酶活力和以MFA為底物時(shí)的最大催化反應(yīng)速度（

V

max ）最高，以MCA、MpCA、MFA、MSA為底物時(shí)測(cè)得的

k

cat /

K

m 值分別為255、237、112.64、96.85 L/（mol·min）。按文獻(xiàn)所述，基于底物特異性和序列相似性對(duì)FAE進(jìn)行分類時(shí)，能夠同時(shí)水解MFA、MpCA和MSA，但不能水解MCA的FAE歸類為A型，且序列與脂肪酶相似；能夠同時(shí)水解MFA、MpCA和MCA，但不能水解MSA的FAE歸類為B型，其序列與乙酰木聚糖酯酶相似；能夠同時(shí)水解上述4 種底物的可以歸類為C型或D型，其中C型序列與綠原酸酯酶或鞣酸酶相似，D型序列與木聚糖酶相似。這種早期在沒有大量FAE氨基酸序列作為參考時(shí)，僅基于底物特異性進(jìn)行的4 種類型分類法具有一定的局限性，目前基于FAE氨基酸序列聚類分析法可以將FAE更為科學(xué)地分類為7 種，甚至11 種。因此，本研究中雖然rAtFAE能夠同時(shí)水解4 種底物且按照底物特異性分類法不能歸類為A型FAE，但由于氨基酸序列聚類分析時(shí)發(fā)現(xiàn)AtFAE可以與部分曲霉來源的A型FAE聚為一類，且序列與脂肪酶相似（圖1），因此參考更為細(xì)化的序列比對(duì)聚類分析法將AtFAE歸類為A型FAE。

6 rAtFAE在FA制備中的應(yīng)用

6.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)FA釋放量的影響

由于FA被半纖維素包裹，木聚糖酶可以水解植物細(xì)胞壁中的半纖維素，同時(shí)有一定量的FA通過酯鍵與多糖和蛋白質(zhì)結(jié)合的交聯(lián)體和游離的FA被釋放出來，而加入FAE可以水解FA交聯(lián)體中的酯鍵，提高FA的釋放量。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在分別利用rAtFAE、木聚糖酶以及兩種酶的組合實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)A的釋放量均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且均于4 h后達(dá)到最大值（圖6）。而單獨(dú)使用木聚糖酶的作用效果要優(yōu)于rAtFAE，而在兩種酶的組合實(shí)驗(yàn)中FA的釋放量最高，表明在水解麩皮釋放FA的過程中，兩種酶具有較好的協(xié)同作用效果。

6.2 酶添加量對(duì)FA釋放量的影響

為進(jìn)一步研究rAtFAE和木聚糖酶協(xié)同作用效果并尋找一個(gè)合適的添加比例，研究中分別對(duì)兩種酶進(jìn)行了酶量的梯度測(cè)試以及不同的組合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明FA的釋放量與酶的添加量呈正相關(guān)，且在兩種酶的不同組合比例中FA的釋放量均優(yōu)于單一酶種（表5），進(jìn)一步證明了兩種酶之間具有較好的協(xié)同作用。

6.3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇較好的酶組合條件，即木聚糖酶添加量為300 U/g，rAtFAE添加量為50 U/g，然后選取溫度、pH值和料液比3 個(gè)因素并利用Design-Expert 13進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)，以優(yōu)化FA的酶催化制備工藝。以FA釋放量為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

對(duì)表6中FA的釋放量使用Design-Expert 13進(jìn)行方差分析與回歸模型建立，結(jié)果發(fā)現(xiàn)料液比對(duì)FA的釋放量影響最大，其次是溫度、pH值，結(jié)果如表7所示。

該模型

R

2 ＝0.933 4、

P

＜0.01，失擬項(xiàng)

P

＞0.05，說明該模型較為可靠，通過軟件擬合，得到響應(yīng)值與試驗(yàn)因素的二次回歸方程：

Y

＝1 718.14＋50.34×

A

－8.71×

B

＋164.34×

C

－13.12×

AB

－4.16×

AC

－52.14×

BC

－4.7×

A

2－80.67×

B

2－64.9×

C

2，其中

Y

為FA釋放量/（μg/g），

A

為溫度，

B

為pH值，

C

為料液比。由Design-Expert 13軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面圖的繪制，結(jié)果如圖7所示。

通過Design-Expert 13軟件分析對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化預(yù)測(cè)，得出單位FA釋放量最高條件為：溫度50 ℃、pH 5.033、料液比1∶35（g/mL），最優(yōu)條件下預(yù)測(cè)單位FA釋放量為1 907.05 μg/g。在最優(yōu)條件下進(jìn)行5 次平行驗(yàn)證，獲得FA釋放量為（1 876.45±30.05）μg/g，是預(yù)測(cè)值的98.39%，與預(yù)測(cè)值接近，說明該模型精準(zhǔn)度高，預(yù)測(cè)結(jié)果可靠。混合酶作用后FA的釋放量相比較于300 U/g單一木聚糖酶條件下（（776.35±30.03）μg/g）和50 U/g rAtFAE條件下（（515.27±18.64）μg/g）約提高了2.42 倍和3.64 倍。而龔燕燕等使用FaeA（56 U）和Xyn11（300 U）混合時(shí)從0.5 g去淀粉麥麩中釋放了1.5 mg FA。Fu Zhilei等使用BpFae（60 U）和XynA（300 U）混合時(shí)從0.5 g去淀粉麥麩中釋放了1.58 mg FA，其結(jié)果均證明FAE與木聚糖酶具有良好的協(xié)同作用，木聚糖酶的添加能促進(jìn)FAE高效的釋放FA。

本實(shí)驗(yàn)的目的在于探究FAE與木聚糖酶之間存在良好協(xié)同作用的同時(shí)，添加FAE提高木聚糖酶的水解效率，以降低混合酶的使用量就可以達(dá)到單一酶高使用量的效果。Gong Yanyan等使用單一reAuXyn11A（300～1 200 U）處理0.5 g去淀粉麥麩，F(xiàn)A最大釋放量為0.77 mg，Liu Zhenghui等使用木聚糖酶（200 U）處理0.5 g淀粉麥麩，F(xiàn)A最大釋放量為0.64 mg，從上述報(bào)道結(jié)果可以看出，單一使用木聚糖酶，麩皮中FA的釋放量有限，而Fu Zhilei等也論證了在木聚糖酶中加入FAE可以大幅提高FA的釋放量，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了該結(jié)論。

結(jié) 論

本研究在前期實(shí)驗(yàn)中篩選得到一株土曲霉，從中克隆得到一種FAE編碼基因并在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)異源重組表達(dá)，重組酶rAtFAE表達(dá)量為（17.38±0.34）U/mL，約為原始菌株表達(dá)量的35 倍。利用工程菌發(fā)酵及His親和層析法獲得重組蛋白rAtFAE，理化性質(zhì)研究結(jié)果顯示rAtFAE分子質(zhì)量約為39 kDa。最適溫度為50 ℃時(shí)，在50 ℃以下較為穩(wěn)定；最適pH值為6.0，在pH 5.5～6.5范圍內(nèi)具穩(wěn)定性較好；Fe2+（2.5 mmol/L）對(duì)該酶具有顯著的促進(jìn)作用，而Ca2+、Mn2+以及Tween-80（0.01%、0.02%）和Triton X-100（2.5～10 mmol/L）對(duì)該酶具有顯著的抑制作用。雖然AtFAE可以同時(shí)水解MSA、MpCA、MFA和MCA 4 種底物，但由于氨基酸序列聚類分析時(shí)發(fā)現(xiàn)AtFAE可以與部分曲霉來源的A型FAE聚為一類，且序列與脂肪酶相似，因此參考更為細(xì)化的序列比對(duì)聚類分析法將AtFAE歸類為A型FAE。

此外，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果論證發(fā)現(xiàn)rAtFAE與木聚糖酶在水解麩皮制備FA的過程中具有較好的協(xié)同作用效果，后續(xù)研究中采用中心組合試驗(yàn)對(duì)溫度、pH值和料液比3 個(gè)因素進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，獲得制備FA的最適酶反應(yīng)條件為：溫度50 ℃、pH 5.033、料液比1∶35（g/mL），利用該條件獲得FA的釋放量為（1 876.45±30.05）μg/g。綜上所述，本研究對(duì)土曲霉FAE（AtFAE）的異源高效表達(dá)、理化性質(zhì)及其在FA制備中的應(yīng)用進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，為后續(xù)開展該酶的工業(yè)化高效制備和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

作者簡(jiǎn)介

通信作者：

李松副教授，畢業(yè)于江南大學(xué)，發(fā)酵工程工學(xué)博士，現(xiàn)任職安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師，美國(guó)密歇根州立大學(xué)訪問學(xué)者。主要從事工業(yè)微生物育種、發(fā)酵控制、酶工程等領(lǐng)域的研究和教學(xué)工作。先后主持或參與國(guó)家自然科學(xué)基金、省自然科學(xué)基金、省重點(diǎn)研發(fā)等項(xiàng)目10余項(xiàng)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文20余篇、授權(quán)發(fā)明專利10余項(xiàng)。

第一作者：

韓紅祥，在研究生期間專注于發(fā)酵優(yōu)化，并使用1-100 L 發(fā)酵罐放大發(fā)酵優(yōu)化目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量，并對(duì)蛋白質(zhì)使用AKTA儀器進(jìn)行梯度純化等核心技術(shù)領(lǐng)域，將學(xué)習(xí)和實(shí)驗(yàn)的過程當(dāng)作自己的事業(yè)去看待并積累了扎實(shí)的專業(yè)知識(shí)和技術(shù)支撐。

本文《土曲霉阿魏酸酯酶異源表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)及在阿魏酸制備中的應(yīng)用》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第15期155-163頁，作者：韓紅祥，郭成城，魏勝華，陳阿娜，李松*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250224-115。點(diǎn)擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：劉芯；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方 閱讀原文 即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)