《食品科學》：江西中醫藥大學李哲教授等：納晶纖維素口服安全性及腸道菌群調節作用

纖維素是一種由重復

-葡萄糖醛酸單元通過1,4-糖苷鍵連接的線性大分子。納晶纖維素（CNC）是一種直徑為30～50 nm、長度為50～500 nm的棒狀或針狀納米級纖維素。目前，CNC主要通過酸水解、酶水解和高壓均質等工藝提取。

在食品領域，CNC在作為增稠劑、穩定劑、功能性配料和包裝材料等方面有潛在的應用，常被作為乳劑和水凝膠等遞送載體的重要組成部分。制備CNC的來源多種多樣，而從生物廢棄物中提取CNC已經成為重要來源，常見的生物廢棄物有棉花、甘蔗渣、果蔬廢料、油棕櫚空殼及谷物秸稈等。

由于人體小腸內缺乏纖維素酶，因此CNC不能被人體消化，而在結腸和回腸中與腸道菌群相互作用并影響其代謝。已有研究表明CNC因粒徑小、純度高和親水性高等特點，對腸道菌群有較好調節作用。本課題組前期已從廢棄油茶果殼中通過硫酸水解法和磷酸水解法制備了性質多樣的CNC并對其理化性質進行了表征。

江西中醫藥大學的明良山、肖 楠、李哲*等將制得的硫酸納晶纖維素（S-CNC）和磷酸納晶纖維素（P-CNC）灌胃小鼠，根據小鼠灌胃后活動行為、體質量、體成分、臟器系數、血清指標及臟器切片進行口服安全性評估；采集糞便進行16S rDNA高通量測序分析S-CNC和P-CNC對腸道菌群的調節作用，以期為CNC安全性評估提供重要的科學依據，有助于確保其在應用過程中的安全性以及對腸道疾病治療作用。

1 小鼠基礎指標觀察

處死前，各組小鼠均未出現死亡。解剖過程中未發現小鼠各臟器出現質地、形態、體積及顏色等異常變化。各組小鼠也未出現低活性、豎毛、顫動、呼吸困難和抽搐等中毒現象。由圖1A、B可知，在灌胃S-CNC和P-CNC后，S-CNC_M組、S-CNC_F組、P-CNC_M組和P-CNC_F組體質量與Control_M組和Control_F組相比無顯著性差異（

P

＞0.05），表明S-CNC和P-CNC對雌、雄小鼠的體質量無影響。如圖1C～H所示，與Control_M組和Control_F組相比，S-CNC_M組、S-CNC_F組、P-CNC_M組和P-CNC_F組的脂肪、液體及瘦肉含量均無顯著性差異（

P

＞0.05），但第7天S-CNC_F組和P-CNC_F組脂肪增加，可能由于數據波動。綜合結果說明S-CNC和P-CNC對小鼠的體成分無影響。各組臟器系數結果如圖1?、J所示。與Control_M組和Control_F組臟器系數相比，S-CNC_M組、S-CNC_F組、P-CNC_M組和P-CNC_F組臟器系數結果顯示差異無統計學意義（

P

＞0.05），表明灌胃S-CNC及P-CNC對于小鼠臟器未造成損傷。

2 組織切片

對小鼠各臟器組織切片和HE染色觀察，結果如圖2所示。灌胃S-CNC及P-CNC對小鼠心、肝、脾、肺、腎、結腸和直腸與空白組相比無明顯差異。S-CNC_M組、S-CNC_F組、P-CNC_M組和P-CNC_F組的心內膜結構清晰，心壁、心室、心肌纖維的形態以及間質無異常，內皮細胞心肌細胞完整有序。肝小葉和肝索結構清晰可辨別，肝實質細胞形態正常。脾臟大小正常，并且沒有出現炎癥情況。肺泡均勻，間隔良好。腎臟無發炎且腎小球無纖維化，腎小管無擴張。結腸及直腸杯狀細胞，腸腺完整，腸黏膜無潰爛現象。綜合HE染色組織切片觀察結果，表明大劑量的S-CNC及P-CNC沒有影響正常小鼠的器官。

3 血液指標

檢測S-CNC和P-CNC對正常小鼠血清生物學指標的影響，其中ALT和AST反映肝功能，而UA和Urea反映腎功能。通過與空白組血清生物標志物比較可知（圖3），S-CNC_M組和P-CNC_M組的血清生物學指標ALT、AST、UA和Urea的水平與Control_M組均無顯著性差異。S-CNC_F組的血清生物學指標ALT、AST、UA和Urea的水平與Control_F組均無顯著性差異。而P-CNC_F組的血清生物學指標UA和Urea水平相比于Control_F組有顯著性差異，但其值在正常含量范圍內，結合切片結果可知其對于腎功能未造成影響。綜合分析結果表明灌胃S-CNC和P-CNC對正常小鼠的肝臟及其腎臟功能無影響。

4 小鼠腸道菌群變化

4.1

多樣性分析

Rank豐度曲線可以直觀地反映出物種的豐富度和均勻度。如圖4A所示，在Control_M組和Control_F組中，OTUs數量分別為868和814，而S-CNC_M組、S-CNC_F組、P-CNC_M組和P-CNC_F組的OTUs數量分別為775、767、789和641。表明灌胃S-CNC和P-CNC后，正常雌、雄小鼠的腸道菌群的豐富度降低。Chao1指數反映了腸道微生物群的豐富度，而Shannon指數反映了腸道微生物群的均勻度。由圖4B、D可知，Control_M組的Chao1指數和Shannon指數分別為1 218.33、6.43，而S-CNC_M組和P-CNC_M組的Chao1指數分別為1 110.55、1 093.35，Shannon指數分別為5.11、5.45。灌胃S-CNC對雄性小鼠Chao1指數無顯著性影響，灌胃P-CNC顯著降低了雄性小鼠的Chao1指數（

P

＜0.05）。灌胃S-CNC和P-CNC顯著降低了正常雄性小鼠腸道菌群的均勻度（

P

＜0.01、

P

＜0.05）。由圖4C、E可知，Control_F組的Chao1指數和Shannon指數分別為1 151.81、6.26，而S-CNC_F組和P-CNC_F組小鼠的Chao1指數分別為1 114.40、931.75，Shannon指數分別為5.98、4.99。灌胃S-CNC對雌性小鼠的Chao1指數和Shannon指數無顯著性影響，灌胃P-CNC高度顯著降低了雌性小鼠的Chao1指數和Shannon指數（

P

＜0.001）。

綜合Rank豐度曲線、Chao1指數和Shannon指數分析，結果表明，與Control_M組和Control_F組相比，S-CNC_M組和S-CNC_F組的腸道菌群豐富度差異無統計學意義（

P

＞0.05），腸道菌群的均勻度受到小鼠性別的影響。而P-CNC組雄性小鼠腸道菌群的豐富度和均勻度顯著降低（

P

＜0.05），雌性小鼠腸道菌群的豐富度和均勻度高度顯著降低（

P

＜0.001）。

4.2

多樣性分析

主成分分析（PCA）和相似性分析（ANOS?M）可以直觀地反映出樣本之間的差異。在PCA圖中，樣本與樣本之間的點距離越近，表明樣本之間的相似度越高。如圖5A、B所示，基于OTUs水平的PCA和主坐標（PCoA）分析表明，與Control_M組和Control_F組相比，S-CNC_M組、S-CNC_F組、P-CNC_M組和P-CNC_F組腸道菌群組成存在差異。此外，為了進一步證明樣本之間的差異程度，采用ANOS?M證明各組間的差異，如圖5C、D所示。結果表明灌胃S-CNC和P-CNC較小程度的改變了正常雌、雄小鼠腸道菌群的組成（

R

＝0.344 6、

P

＝0.001；

R

＝0.445 9、

P

＝0.001）。P-CNC_M組腸道菌群組成與Control_M組相似；S-CNC_F組腸道菌群組成與Control_F組相似。表明灌胃S-CNC和P-CNC對正常雌、雄小鼠腸道菌群的組成影響較小，且不同CNC對小鼠腸道微生物組成影響有性別差異。

4.3 小鼠腸道菌群門分類水平物種組成的影響

從門水平上分析，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是雌、雄小鼠腸道菌群中的主要菌門。與Control_M組相比，S-CNC_M組和P-CNC_M組厚壁菌門的相對豐度從（49.92±6.95）%降低到（47.27±15.96）%、（44.42±13.86）%，S-CNC_M組擬桿菌門的相對豐度從（26.86±8.10）%降低到（14.60±6.06）%；而P-CNC_M組擬桿菌門的相對豐度增加到（32.01±11.32）%（圖6A）。與Control_F組相比，S-CNC_F組和P-CNC_F組的厚壁菌門的相對豐度從（56.85±6.03）%分別增加到（58.66±9.40）%、（61.13±7.54）%；兩組擬桿菌門的相對豐度分別從（24.09±9.53）%降低到（19.19±2.37）%和（9.96±4.43）%。擬桿菌門與厚壁菌門的比值（F/B）可以反映出小鼠的紊亂情況及小鼠的能量代謝。為進一步了解腸道菌群的分布情況，對擬桿菌門與厚壁菌門的比值（F/B）進行分析（圖6B）。結果表明灌胃S-CNC對雌、雄小鼠F/B值的影響無顯著性差異。而灌胃P-CNC增加了雌性小鼠的F/B值，且具有顯著性差異（

P

＜0.000 1）。表明灌胃P-CNC對正常雌性小鼠腸道菌群有影響。

4.4 小鼠腸道菌群科分類水平物種組成的影響

從菌科水平上分析，相對豐度排名前10 位的菌科有腸桿菌科（Muribaculaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、動球菌科（Planococcaceae）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、阿克曼氏菌科（Akkermansiaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、酵母科（Saccharimonadaceae）、弧菌科（Vibrionaceae）和脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae)。通過Circos圖對其科水平的豐度進行分析（圖6C）。結果表明與Control_M組相比，S-CNC_M組動球菌科、丹毒絲菌科、莫拉氏菌科、阿克曼氏菌科及脫硫弧菌科的相對豐度增加，而腸桿菌科、毛螺菌科、乳桿菌科、酵母科、弧菌科的相對豐度降低；而P-CNC_M組腸桿菌科、動球菌科、丹毒絲菌科、阿克曼氏菌科及弧菌科的相對豐度增加，毛螺菌科、莫拉氏菌科、乳桿菌科、酵母科及脫硫弧菌科的相對豐度降低。S-CNC_F組動球菌科、莫拉氏菌科、阿克曼氏菌科及弧菌科的相對豐度較Control_F組增加，而腸桿菌科、毛螺菌科、丹毒絲菌科、乳桿菌科、酵母科及脫硫弧菌科的相對豐度較Control_F組降低。與Control_F組相比，P-CNC_F組的動球菌科、莫拉氏菌科、阿克曼氏菌科和弧菌科的相對豐度增加，而腸桿菌科、毛螺菌科、丹毒絲菌科、乳桿菌科、酵母科及脫硫弧菌科的相對豐度降低。其每組樣本和腸道菌群科的相對豐度關系見圖6C的Circos圖。圖6D、E的線性判別分析效應量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析柱狀圖及分支進化圖結果表明灌胃S-CNC和P-CNC均改變了正常雌、雄小鼠的腸道菌群的結構。

4.5 小鼠腸道菌群屬分類水平物種組成的影響

在菌屬水平上分析（圖7A），雌、雄小鼠腸道菌群屬水平主要包括毛螺菌屬（

Lachnospiraceae

_NK4A136_group）、不動桿菌屬（

Acinetobacter

）、庫特菌屬（

Kurthia

）、杜氏桿菌屬（

Dubosiella

）、梭菌屬（

Faecalibaculum

）、阿克曼菌屬（

Akkermansia

）、硫化細菌屬（

Solibacillus

）、乳桿菌屬（

Lactobacillus

）、假絲酵母菌屬（

Candidatus_Saccharimonas

）及弧菌屬（

Vibrio

）。為進一步分析其影響的程度，如圖7B、C所示，采用Tukey HSD統計方法對前10 個菌屬進行了統計學分析。與Control_M組相比，S-CNC顯著地增加了雄性小鼠腸道菌群中

Faecalibaculum

Akkermansia

的相對豐度（

P

＜0.05），顯著地降低了

Lactobacillus

Candidatus_Saccharimonas

相對豐度（

P

＜0.05）。灌胃P-CNC高度顯著地降低了雄性小鼠腸道菌群中

Candidatus_Saccharimonas

的相對豐度（

P

＜0.001），同時雄性小鼠腸道菌中

Lactobacillus

的相對豐度顯著降低（

P

＜0.05）。與Control_F組相比，S-CNC_F組

Acinetobacter

相對豐度顯著增加（

P

＜0.05）。P-CNC_F組腸道中

Kurthia

Vibrio

相對豐度高度顯著增加（

P

＜0.001），

Solibacillus

相對豐度極顯著性增加（

P

＜0.01），

Akkermansia

相對豐度顯著性增加（

P

＜0.05）；而雌性小鼠腸道中

Lachnospiraceae

_NK4A136_group和

Faecalibaculum

相對豐度顯著降低（

P

＜0.05）。表明灌胃S-CNC可以有效增加雄性小鼠有益菌屬的相對豐度。相反，灌胃P-CNC降低了雄性小鼠有益菌屬的相對豐度。

4.6 小鼠腸道菌群科分類水平物種組成的影響

P?CRUSt2功能預測分析揭示了不同CNC灌胃雌、雄小鼠盲腸涉及到的代謝通路，主要包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝、萜類化合物和聚酮類化合物代謝、其他氨基酸代謝、脂質代謝、復制和修復、能量代謝、異生素生物降解和代謝及聚糖生物合成和代謝，其具體通路見圖8。

通過對其主要的功能進行統計學分析，結果表明灌胃P-CNC顯著地增加了雌性正常小鼠的脂質代謝及異生素生物降解和代謝（

P

＜0.05），對雄性正常小鼠代謝無影響。灌胃S-CNC對正常雌、雄小鼠的代謝無影響。肥胖、糖尿病、心血管疾病及腸道炎癥與脂質代謝有重要關 系。而膳食纖維因出色的發酵能力可以產生各種短鏈脂肪酸直接或間接調節腸道內穩態和脂質代謝。CNC作為一種膳食纖維調節脂質代謝治療疾病的作用機制還需要進一步研究。

CNC因生物相容性、可降解性及易修飾性等特點，在食品和藥物遞送領域有著應用潛力。雖然纖維素已經被認為是普遍公認安全（GRAS），同時歐盟將其視為食品添加劑。但納米級CNCs尚未被指定為GRAS，因此一些未知特性可能使人類面臨未知的安全問題。團隊前期已從油茶果殼提取了S-CNC和P-CNC并表征以及制備了載揮發油乳劑。不同酸提取的CNC在形狀、分散性和熱穩定性表現出不同特征。在先前研究中，S-CNC粒徑為（206.9±1.823）nm，而P-CNC粒徑為（646.8±11.420）nm，而S-CNC比P-CNC的電位值大，這可能因為CNCs表面存在帶負電荷的硫酸鹽基團，導致相鄰CNCs顆粒之間發生靜電排斥。在熱穩定性方面，P-CNC的最大降解溫度為288.91 ℃，而S-CNC為227.01 ℃。此外，S-CNC和P-CNC在作為乳液穩定劑遞送揮發油中也表現出不同行為，S-CNC穩定乳劑對揮發油包封率為50.67%，而P-CNC為44.67%。S-CNC穩定乳劑比P-CNC穩定乳劑粒徑更小，乳液更穩定，同時S-CNC穩定乳液比P-CNC穩定乳液抗菌效果更好。不同提取方式的CNC會有不同性質，所以對其在體內的安全性及作用有必要進行研究。

本實驗進一步對不同提取方式制得的CNC灌胃雌、雄小鼠進行安全性評價，結果顯示S-CNC與P-CNC對小鼠的活動行為、體質量及臟器系數均無影響。通過血清檢測和組織病理觀察，S-CNC和P-CNC對ALT、AST、UA和Urea血液檢測指標沒有影響，對心、肝、脾、肺、腎、結腸以及直腸均無損傷，這與Wang Mingzheng等報道的S-CNC灌胃小鼠進行安全性評價結果一致。表明S-CNC和P-CNC在體內均表現出良好生物安全性，不影響正常雌、雄小鼠的生長，沒有顯著性差異。同時，實驗結果表明小鼠在灌胃S-CNC和P-CNC劑量2 000 mg/kg時，實驗小鼠的存活率為100%，且未表現出明顯的毒性行為，故根據全球化學品毒性等級歸類將S-CNC和P-CNC分類為第五類，即無明顯急性中毒的危險性物質。

腸道是人體最大的吸收器官和免疫器官，而腸道微生物對人體健康許多方面有著關鍵作用，包括免疫系統代謝和神經行為特征。而CNC因較強的親水性和較高的吸附能力，可以吸收腸道毒素，改善腸胃健康。使用16S rDNA高通量測序技術分析小鼠腸道菌群多樣性及組成，結果表明，S-CNC和P-CNC對正常雌、雄小鼠的腸道菌群多樣性及結構具有調節作用，且S-CNC和P-CNC對腸道菌群影響有顯著差異。在豐富度和均勻度上，S-CNC降低了雄性小鼠腸道菌群的均勻度，而P-CNC不僅降低了雌、雄小鼠腸道菌群的均勻度，同時其豐富度也顯著降低。此外，Wang Mingzheng等使用CNC治療便秘，便秘模型組的Chao1指數和Shannon指數從對照組的371.02和6.50降至350.70和5.41，經CNC灌胃后，Chao1指數和Shannon指數上升至378.39和6.47。CNC有效改善了便秘小鼠的豐富度和均勻度。在

多樣性中，P-CNC_M組的腸道菌群組成與Control_M組較相似，而S-CNC_M組腸道菌群組成與Control_M組相比發生變化；S-CNC_F組腸道菌群組成與Control_F組較相似，P-CNC_F組腸道菌群組成與Control_F組相比發生改變。在

多樣性中，S-CNC和P-CNC對雌、雄小鼠腸道菌群的影響相反。表明灌胃S-CNC和P-CNC對正常雌、雄小鼠腸道菌群的組成有一定的改變作用，且有著顯著性差異。

S-CNC和P-CNC對雌、雄小鼠腸道菌群組成在門、科及屬水平上都有一定影響，且有性別差異。在門水平上，厚壁菌門包括眾多有益菌，其中乳酸桿菌是酸奶及發酵乳品中常見的益生菌，厚壁菌門微生物代謝產生的乙酸鹽及乳酸鹽等短鏈脂肪酸鹽，可調整腸道內共生菌群比例，在緩解腸道炎癥反應和調節免疫平衡等方面有一定作用。在本實驗中S-CNC組和P-CNC_F組中厚壁菌門相對豐度增加。S-CNC和P-CNC在一定程度上增加了有益菌的相對豐度。腸桿菌科是一個優勢科也是降解復雜碳水化合物所必需的。在科水平上，腸桿菌科最常見，本實驗中Control_M組腸桿菌科相對豐度為22.31%，而P-CNC_M組為29.48%。結果表明灌胃P-CNC增加了雄性小鼠的腸桿菌科相對豐度。在另一項研究中，探索可溶性纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維素（insoluble dietary fiber，?DF）對小鼠便秘的作用。模型組中檢測到腸桿菌科相對豐度為23.49%，經過SDF和?DF的干預可增加至34.21%和33.53%。除此之外，在科水平上，S-CNC_M組的莫拉氏菌科及脫硫弧菌科相對豐度增加，弧菌科相對豐度降低，而P-CNC_M組的莫拉氏菌科及脫硫弧菌科相對豐度降低，弧菌科相對豐度增加；S-CNC_M組丹毒絲菌科及脫硫弧菌科相對豐度增加，而S-CNC_F組丹毒絲菌科及脫硫弧菌科相對豐度降低；P-CNC_M組丹毒絲菌科相對豐度增加，而P-CNC_F組丹毒絲菌科菌科的相對豐度降低。S-CNC和P-CNC對一些菌群相對豐度的影響呈相反趨勢，同時對雌、雄小鼠的菌科相對豐度影響不同。在屬水平上，哺乳動物腸道中的阿克曼菌屬微生物均為嗜黏白阿克曼氏菌（

Akkermansia muciniphila

），這是一種潛在益生菌。本實驗中灌胃S-CNC增加了雄性小鼠的阿克曼菌屬的相對豐度。有研究表明，通過S-CNC給予結腸炎小鼠治療時阿克曼菌屬相對豐度從0.11%提高至1.33%，從而增加了杯狀細胞數量和黏液層的厚度。 CNC改善了腸道菌群的多樣性，腸道益生菌相對豐度的增加，恢復腸道屏障，有利于結腸炎的治療。而在屬水平上，S-CNC和P-CNC對一些菌屬的相對豐度有著顯著性差異，S-CNC_M組不動桿菌屬相對豐度增加，而P-CNC_M組不動桿菌屬相對豐度降低。S-CNC_M組杜氏桿菌屬相對豐度增加，S-CNC_F組杜氏桿菌屬相對豐度降低；而P-CNC_M組杜氏桿菌屬相對豐度降低，P-CNC_F組杜氏桿菌屬相對豐度增加。以上表明，S-CNC和P-CNC對腸道菌群的

多樣性及腸道菌群組成在門、科和屬有一定程度的調節，且S-CNC和P-CNC對腸道菌群的調節在一些方面有著相反作用。而S-CNC和P-CNC對緩解與腸道菌群相關疾病的作用還需要進一步探索。

本研究探索了不同提取方式的CNC對小鼠口服安全性評價及對腸道菌群的影響。但只使用了一個劑量灌胃小鼠，未來對多個劑量長周期給藥小鼠可能會進一步研究。腸道菌群與多種疾病相關，CNC作為一種膳食纖維，難以在小腸中消化，可與腸道菌群相互作用，對其有一定調節作用以此治療疾病。目前，CNC以小鼠為模型在治療結腸炎和便秘方面有一定研究，以蜜蜂為模型研究CNC治療以色列急性麻痹病毒的作用機制。但CNC以多種動物模型治療疾病的研究缺乏，而CNC對不同疾病治療與腸道菌群相關機制還需要進一步探索。

結論

CNC在醫藥和食品等領域具有廣泛應用潛力，是重要活性成分的遞送載體。CNC通常被認為是安全的，同時本研究也證實了口服CNC具有較高的安全性，但不同提取工藝的CNC對腸道菌群調節作用尚未證實。所以本實驗在考察S-CNC和P-CNC口服安全性前提下，也考察了S-CNC和P-CNC對腸道菌群的調節作用。S-CNC及P-CNC對雌、雄小鼠生理活動行為、體質量、體成分、臟器及血液成分均無影響，且小鼠的存活率為100%，未表現出明顯毒性。S-CNC和P-CNC改變了正常雌、雄小鼠腸道菌群的豐富度和均勻度，且對雌、雄小鼠腸道菌群的組成在門、科及屬水平上有一定程度改變，以上結果說明了S-CNC和P-CNC是口服安全的且對腸道菌群有調節作用。本研究為CNC在食品和藥學領域的安全應用奠定了基礎。

本文《納晶纖維素口服安全性及腸道菌群調節作用》來源于《食品科學》2025年46卷第6期142-155 頁， 作者：明良山，肖 楠，劉 澳，蕭子健，劉紅寧，李 哲* 。 DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20240920-161 。點擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關信息。

實習編輯：林安琪；責任編輯：張睿梅。點擊下方 閱讀原文 即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

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