FSHW | 選定的益生菌組合在模擬的面筋和小麥面包消化過程中的代謝特征

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Abstract

益生菌在胃腸道環境中進行代謝活動，通過提高免疫力、治療代謝紊亂、調節微生物群和代謝組來影響宿主的健康。由于谷蛋白相關疾病的高發病率，本研究旨在深入探討兩種選定的微生物群（MCs）在模擬胃腸道條件下谷蛋白消化過程中的代謝。這兩種MCs以高蛋白酶和肽酶活性為特征，涉及與兩種商業蛋白酶酶結合的不同乳酸菌和芽孢桿菌株。面筋底物被用作純化提取物、白面包和全麥面包。相反，對照樣品依賴于微生物酶的缺乏。24 h的模擬消化足以完全水解兩個含有MCs的實驗組中的谷蛋白，并且48 h消化的提取物沒有改變乳糜瀉（CeD）患者十二指腸活檢中的細胞因子表達。當檢測消化樣品的抗氧化和植酸酶活性時，微生物酶顯著提高了ABTS和DPPH的清除活性，并降低植酸濃度。通過檢查游離氨基酸譜可以區分這兩個MCs，而檢測異質性揮發性有機化合物組分支持微生物酶的存在/活性，而MC之間沒有統計學顯著差異。作為功能貢獻，含有MCs的消化提取物還被證明可以降低暴露于脂多糖觸發物的細胞系中的炎性細胞因子濃度。因此，與探索新型輔助療法的研究一致，目前以高谷蛋白水解代謝為特征的創新益生菌聯盟也顯示出改善受谷蛋白相關疾病或CeD患者通常會改變的各種參數的能力。

Introduction

益生菌作為酶源對由于缺乏特定酶而不能被宿主直接消化的底物的有效性。因此，益生菌可以作為輔助療法被利用，它們在腸道中的活動可以減緩許多由大規模發病引起的病理的進展，包括肥胖、糖尿病、腸易激疾?。↖BD）、非酒精性脂肪肝和腎病。在易感患者中，益生菌還可以減少因不耐受引起的副作用，包括廣泛的基于面筋的疾病，即乳糜瀉（CeD）、小麥依賴性運動誘發的過敏反應、呼吸道過敏、非乳糜瀉面筋敏感性和面筋依賴性腸易激綜合癥。

無論病因和面筋敏感程度如何，無面筋飲食（GFD）是用于對抗乳糜瀉不良癥狀的獨特療法。然而，盡管遵循GFD，患者的健康仍然受到食物交叉污染和家庭的飲食習慣的損害。以及聲稱無面筋的食品，這些食品實際上超過了20×10-6的安全限值。此外，由于GFD提供的谷物攝入量減少，以及由此導致的微營養素和纖維營養不足，不能建議將無面筋飲食視為平衡的飲食模式，從而導致營養不良相關疾病的風險增加。

因此，考慮到在非乳糜瀉面筋敏感性中不完全面筋剝奪的重要性，最合適的方法之一是通過口服應用酶或表達酶的益生菌來改善患者的消化。由于與面筋表位釋放相關的潛在風險，益生菌途徑已被公認為是具有高度治療潛力和針對宿主生理功能的多種功能的高影響力的吸引策略。雖然對宿主狀態的整體貢獻尚未評估，但先前的研究表明，通過施用活益生菌或酶提取物可以改善非乳糜性面筋敏感患者的腸道微生態。

此外，由于谷蛋白中脯氨酸的含量較高，且宿主無法合成脯氨酸蛋白酶，富含脯氨酸的谷蛋白片段會到達小腸。最近的文獻探索了創新配方，有助于消化谷蛋白及其免疫毒性衍生物。事實上，在細菌、真菌和植物界中，蛋白酶和靶向脯氨酸的蛋白酶非常普遍。在模擬消化系統中，黑曲霉的脯氨酰內切酶能夠將谷蛋白高效代謝成非免疫原性肽。并在體內觀察到了有希望的結果。考慮到至少需要5種蛋白酶才能完全水解谷蛋白及其免疫毒性表位。在前面的工作中，組裝了一個微生物共生體（MC），即MC16，其特點是蛋白酶和肽酶的互補活性。通過細致的步驟選擇，可以獲得能夠在不到24 h內水解0.5 g面筋的MC。在設置體內試驗之前，這里進行的實驗設計旨在使用兩種不同的商業酶來改善MC16對面筋水解的代謝，這些酶有助于消化20倍增加的面筋量。

本研究文章還旨在驗證MC16的整體代謝，擴展對互補功能應用的評估，以改善宿主健康。本研究廣泛檢查了MC16的代謝，并將其結果與先前組裝的具有中間蛋白水解活性的MC12的結果進行了比較。兩種MCs中都含有活性的乳酸菌（LAB）、芽孢桿菌菌株和它們的細胞質提取物。除了微生物酶，兩種不同的商業酶也被添加到兩種MCs中（MC12和MC16）并在模擬的人類胃腸道條件下進行測試。因此，對消化提取物的殘留面筋含量、清除活性、抗營養因子、代謝組學（游離氨基酸（FAAs）和揮發性有機化合物（VOC））、免疫毒性和抗炎活性進行了測定。

Result

在模擬的胃腸道條件下，對兩種具有不同蛋白水解活性的MCs的谷蛋白代謝進行了檢查。MC12和MC16之前已經組裝并測試了5 g白面包的谷蛋白水解能力。與測試的其他共生體（MC16）相比，MC12只觀察到部分水解，而MC16能夠在相同的48 h模擬消化時間內完全水解麥膠蛋白。

清除活性

基于ABTS和DPPH測試，通過48 h消化樣品的水提取物的清除活性進行評估（圖1A）。與不含MCs的樣品相比，ABTS和DPPH測試均支持微生物在增加抗氧化活性平均值方面的巨大貢獻。MC12和MC16的最高清除活性在CWB消化期間被發現，實際上，ABTS和DPPH測試顯示值高于3.5 μmol/mL。值得注意的是，即使在消化CG和CB的實驗組中，與不含微生物酶的樣品相比，MCs也增加了清除活性。

抗氧化劑的測定也進行在LAB和芽孢桿菌菌株純培養物上?？傮w而言，純培養物的提取物顯示出比消化樣品中更高的清除活性值（圖1B）。然而，當以類似于整個MC12和MC16活性的方式加權單個貢獻時，MC12和MC16之間不存在差異。

圖1 （A）消化對照樣品的水提取物中商業酶和含有活細胞和裂解細胞的實驗樣品（MC12和MC16）以及商業酶的清除活性條形圖；（B）MC12和MC16中包含的菌株純培養物水提取物中抗氧化活性的條形圖

植酸代謝和植酸酶活性測定

在消化樣品中，植酸酶活性和植酸之間存在反相關性（圖2A）。在對照樣品中（即使含有商業酶）未檢測到植酸酶活性，12個含MC樣品中有3個（CG-Tolerase-MC12、CG-Tolerase-MC16和CWB-Tolerase-MC12）也表現出無活性。CG-Promod-MC12表現出最高的植酸酶活性（（1.50±0.04）U），而CWB和CWB-Promod表現出最高的植酸值（分別為0.38和0.41 g/100 g）。

LAB和芽孢桿菌菌株MC12和MC16的植物酶活性進行了單獨測定（圖2B）。結果顯示，從（0.76±0.04）U（在戊糖片球菌DSM33371中測定）到（5.56±0.03）U（在短小芽孢桿菌DSM33355中測定）不等。此外，當檢查副干酪乳桿菌DSM33373的提取物（（4.64±0.07）U）和短小芽孢桿菌DSM33297的提取物（（4.42±0.02）U）時，評估了高植物酶活性。

通過將純培養物中單獨測定的植酸酶活性值相加，屬于MC16的菌株顯示出顯著高于MC12的值（（22.84±0.47）、（16.83±0.52）U）。

圖2 （A）消化對照樣品的水提取物的植酸酶活性和植酸測定的條形圖；（B）在MC12和MC16中所含菌株的純培養水提取物中測量的植酸酶活性條形圖

氨基酸代謝

在氨基酸代謝方面，48 h消化的樣品被用于分析FAA和氨的濃度。平均總FAA為3372.43 mg/kg，范圍在CB-Promod中為2357.02 mg/kg，在CG-Tolerase-MC12中為6298.70 mg/kg。氨的平均值為327.98 mg/kg，范圍在CBPromod-MC16中為218.47 mg/kg，在CG-tolerase-MC12中為449.76 mg/kg。

在解釋變異分布時，基于PCA的多變量分析揭示了包括MC16-含樣品的明顯聚類，由PC1和PC2的負值支持（圖3A）。相反，除了CG-Promod-MC12，負的PC1分數與正的PC2分數影響了MC12-含樣品的放置。相反，正的PC1分數導致對照樣品重疊。變量矢量負載圖（圖3B）和變量聚類（圖3C）對FAAs（和氨）進行了加權，分為兩個不同的聚類，在圖3C中標記為“a”和“b”。聚類-a包括那些在對照樣品中標記為具有高Z得分的化合物-無論是否添加商業酶-而聚類-b與含有MC12和MC16的消化樣品中具有高Z得分的化合物有關。對聚類-b進行子分類，子集群-b1由于高濃度的Asp、GABA、Lys、Gly和Orn而區分了由MC16消化的樣品，而其他樣品則不同，而子集群-b2包括所有那些由MCs和對照樣品中高釋放的FAAs。

圖3 基于消化控制樣品或100 g白小麥和全麥面包的面團，添加或不添加兩種商業酶的FAA和氨值的PCA（A）得分；（B）載荷圖；（C）熱圖

VOC代謝

在所有樣本中，GC-MS代謝組學共收集了79種屬于不同化學類別的VOC，具體包括醇（5種）、醛（7種）、酯（37種）、烴（6種）、吲哚（1種）、酮（4種）、有機酸（7種）、酚（4種）、萜類（2種）和“其他”化學類別（6種）。根據每種化學類別的相對濃度，PCA解釋的樣品方差分別為35.7%和19.2%，分別對應于第一（PC1）和第二（PC2）成分。負的PC1值導致對照樣本的聚類，即不含MC的樣本（圖4）。相反，含MC的樣本顯示PC1的正值。PC2對聚類的貢獻信息較少。

圖4 VOC的PCA圖

通過進行層次聚類分析，進一步探索了揮發性支鏈氨基酸和芳香族氨基酸（分別簡稱為BCAAs和ArAAs）衍生物以及GC-MS檢測的有機酸。相關的熱圖有助于直觀地將樣品分配到三個不同的集群（CL1、CL2和CL3）中，而變量（即代謝物）主要分配到兩個組（Group-1和Group-2，圖5）。Group-1包括氨基酸代謝產生的揮發性醇和酯，而Group-2包括所有揮發性有機酸。Group-1代謝物的子集群，即Group-1a和Group-1b，對于區分CL1和CL2樣品非常有幫助。查看Z分數，CL1的特征是高值的2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、丁酸3-甲基丁基酯和苯酚，而CL2表現出高Z分數的ArAA衍生物（苯乙基醇）和BCAA衍生物（3-甲基-1-丁醇乙酸酯）。值得注意的是，苯乙基醇是BCAA衍生物中最具代表性的揮發性有機化合物，其代謝主要依賴于MC16與ToleraseG的組合。Group-2代謝物的Z分數較高，允許定義CL3。

圖5 消化樣品中VOCs的歸一化相對濃度（Z分數）的熱圖

為了專門檢查SCFA的代謝，組成MC12和/或MC16的每種菌株都在補充菊粉或低聚果糖的培養基中進行了發酵測試。乙酸是主要的合成SCFA（圖6），平均而言，LAB合成的乙酸和丙酸比桿菌菌株的含量更高，相反，桿菌菌株產生異戊酸的程度更高。在丁酸和異丁酸代謝方面，未檢測到LAB和桿菌菌株之間存在顯著差異。

圖6 在低葡萄糖肉湯培養基中，使用MC12和/或MC16中使用的單菌株純培養物代謝的SCFA絕對濃度（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸和異戊酸）的Δ值

體外評估CeD活檢的免疫激活

為了評估來自CG、CB和CWB的消化樣品是否能誘導CeD患者十二指腸活檢標本的免疫激活，提取了麥膠蛋白和谷蛋白多肽。使用qPCR和ELISA分別在mRNA和蛋白質水平上定量了IL-2、IL-10和IFN-γ。正如預期的那樣，與不含商業酶的控制樣品（RPMI1640+胃和腸液，標記為NegCNT）相比，與不含商業酶的控制樣品相比，與不含商業酶的控制樣品的濃度顯著降低（CG、CB和CWB），以及僅含有商業酶的控制樣品（圖7）。由于存在來自MC12和MC16的微生物酶，因此顯著降低了促炎細胞因子的濃度。由于與NegCNT相比沒有差異（P＞0.05），只有含有MC16酶的樣品被證明可以避免細胞因子表達，幾乎完全避免。

圖7 在十二指腸活檢標本中IFN-γ、IL-2和IL-10的濃度

體外評估抗炎效果

為了更深入地了解巨噬細胞對小鼠BMDCs炎癥的功能作用，測定了暴露于大腸桿菌LPS的細胞上清液中的細胞因子濃度。在基礎培養基（RPMI）中孵育的細胞用作陰性對照，其細胞因子濃度為（229.0±36.6）、（10.0±2.0）和（10.0±0.1）pg/mL，分別對應于TNF-α、IL-6和IL-1β（圖8）。相反，陽性對照是向RPMI中加入LPS，導致細胞因子濃度顯著增加（P＜0.05），即（6008.2±361.2）、（8450±760.5）和（690.3±82.8）pg/mL，分別對應TNF-α、IL-6和IL-1β。在評估巨噬細胞功能活性提供的差異之前，所有消化后的實驗樣品都進行了測試，以確定其在不添加LPS的情況下直接激活細胞細胞因子分泌的作用。與相對陰性對照相比，這些值沒有顯著增加。

圖8 TNF-α（A）、IL-6（B）和IL-1β（C）的細胞因子濃度

MC消化提取物的功能評估是基于細胞因子濃度與同時含有LPS和槲皮素的樣本（RPMI+LPS+AOx）的比較。

TNF-α在CG+MC12+Promod+LPS（圖8A）中的例外情況，所有用2種MC之一消化后的實驗樣品與RPMI+LPS+AOx樣品相比沒有顯著差異。

對于IL-6（圖8B），顯著差異強調了所用商業酶的貢獻。更詳細地說，當Promod與MC結合時，只有CWB+MC16+Promod+LPS與RPMI+LPS+AOx樣品沒有報告顯著差異。當使用耐受酶時，所有含MC16的樣品與RPMI+LPS+AOx樣品沒有表現出顯著差異，而兩個含MC12的樣品（即CB+MC12+耐受酶+LPS、CWB+MC12+耐受酶+LPS）顯示出統計學上的顯著差異。

對于IL-1β（圖8C），所有含有Tolerase+MC12的樣品顯示與RPMI+LPS+AOx相比具有顯著更高的濃度。相反，所有含有Tolerase+MC16的樣品均未報告IL-1β濃度的增加。盡管將商業酶替換為Promod，但與MC16的組合并未導致顯著差異。相反，CG+MC12+Promod+LPS樣品與RPMI+LPS+AOx相比具有顯著更高的IL-1β濃度。

Conclusion

本研究深入剖析了先前組裝的微生物群落，并添加了谷蛋白水解酶進行測試。無論使用哪種商業補充酶，盡管谷蛋白增加了20倍，但在不到24 h內，其代謝濃度降至低于20×10-6。具有適合代謝這種谷物蛋白及其衍生物的微生物完成了這項工作。此外，在白色和全麥面包中觀察到微生物群落具有高的抗氧化、植酸和抗炎活性。營養是促進健康和減少藥物使用的最佳驅動力。考慮到這一點，本研究設計了一個實驗方案，并進行了多次分析，最終確定了能夠改善與谷蛋白相關疾病相關生化指標的MC16微生物群落的特征。因此，整體體外證明的貢獻為體內挑戰性試驗鋪平了道路。

Metabolic characterization of selected probiotic consortia during gluten and wheat bread simulated digestion

Mirco Vaccaa,1, Giuseppe Celanoa,1, Olga Nikoloudakib, Bodo Speckmannc, Francesco Maria Calabresea,*, Marco Gobbettib, Maria de Angelisa

a Department of Soil Plant and Food Sciences, University of Bari Aldo Moro, Bari 70126, Italy

b Faculty of Science and Technology, Free University of Bozen, Bolzano 39100, Italy

c Evonik Operations GmbH, Hanau-Wolfgang 63457, Germany

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

While exerting their metabolic activities in the gastrointestinal milieu, probiotics impact the host well-being by boosting immunity, treating metabolic disorders, and modulating microbiota and metabolome. Due to the high incidence of gluten-based disorders, the present work aims to deeply explore the metabolism of two selected microbial consortia (MCs) during gluten digestion under simulated gastrointestinal conditions. Featured by high protease and peptidase activity, both MCs accounted for different lactic acid bacteria and Bacillus strains that were combined with two commercial protease enzymes. Gluten substrates were used as purified extracts, white and whole wheat breads. Control samples, instead, relied onto the microbial enzyme lack. Twenty-four hours of simulated digestion were sufficient to completely hydrolyze gluten in one of the two MC-containing experimental sets, and the relative 48 h-digested extract did not alter the cytokine expression in duodenal biopsies from celiac disease (CeD) patients. When digested samples were assayed for antioxidant and phytase activities, microbial enzymes demonstrated to significantly improve both 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) scavenging activity and to decrease the phytic acid concentration. The inspection of the free amino acid profiles allowed for distinguishing the two MCs, whereas the detection of a heterogeneous panel of volatile organic compounds supported the presence/activity of microbial enzymes without statistically significant differences between MCs. As functional contribution, digested extracts with MCs also proved to reduce the inflammatory cytokine concentrations in cell lines exposed to lipopolysaccharide trigger. Therefore, in line with studies exploring novel adjuvant therapies, the present innovative probiotic consortium featured by high gluten-hydrolyzing metabolism also showed the capability to improve various parameters usually found to be altered in patients affected by gluten-based disorders or CeD.

Reference:

VACCA M, CELANO G, NIKOLOUDAKI O, et al. Metabolic characterization of selected probiotic consortia during gluten and wheat bread simulated digestion[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(2): 9250033. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250033.

翻譯： 羅敬（實習）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創意

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