《食品科學》：合肥師范學院朱桂蘭教授等：不同接枝順序三元共價復合物對藍莓花青素的穩態作用

藍莓花青素（ACNs）是一種天然水溶性植物色素，屬于類黃酮多酚類化合物，具備延緩神經衰老、預防心血管疾病、調節腸道菌群、增強視力、抑制微生物生長等作用，是一種極具開發潛力和研究價值的食品功能因子。但ACNs在加工和儲存過程中穩定性較差，對光、熱、pH值等條件都較為嚴苛，急切需要一種方法提高ACNs在食品加工、儲運及銷售過程中的穩定性。目前用于提高花色苷穩定性的遞送系統主要有蛋白質遞送系統、多糖遞送系統以及復合遞送系統。眾多研究表明由復合物組成的遞送系統，與單一組分形成的相比，抗不利環境因素能力增強，具有更高的負載率，可以較好地實現復合物對功能因子的緩釋等作用。

乳清蛋白（WP?）具有的優良的結構和功能特性（如乳化活性、起泡性能、凝膠特性等），是構建食品功能因子遞送體系的良好材料。結冷膠（GG）是一種微生物陰離子胞外多糖，由于其分子結構中含豐富的羧基和酰基，與食品中的功能因子具有很強的親和力，易形成穩定復合物，因此常常用作遞送系統的包埋材料。茶多酚（TP）作為一種酚類化合物，其在生物體中能夠顯示出強大的抗氧化性能和生物活性，將TP接枝于不同的生物活性大分子當中，可以賦予其他生物大分子良好的性能特質。

安徽大學生命科學學院周欣，合肥師范學院生物與食品工程學院黃金路、朱桂蘭*等以WP?、GG、TP為原料，制備不同接枝順序的功能因子傳遞體系，負載ACNs。并進一步分析不同接枝順序復合物結構和功能特性的差異以及其在ACNs遞送體系中的應用，以期為新型多功能食品配料的開發和高性能食品傳遞體系的構建提供理論支持。

01

三元復合物的制備與表征

以WP?、GG和TP為原料，采用美拉德接枝法和堿處理法制備不同接枝順序共價復合物（WP?-GG-TP和WP?TP-GG）。用紫外光譜、熒光光譜和紅外光譜對三元復合物進行表征。從圖1可以看出，WP?、GG、TP的最大吸收波長分別為280、265 nm和278 nm，相較于WP?，WP?-GG和WP?-TP的最大吸收波長分別藍移至277 nm和276 nm，表明WP?分別與GG、TP發生了共價結合，導致WP?的空間構象改變，且TP對WP?結構影響更大。曹佳興等研究發現，小麥醇溶蛋白與表沒食子兒茶素沒食子酸酯共價結合后，小麥醇溶蛋白的紫外吸收峰發生明顯藍移。WP?-GG-TP和WP?-TP-GG的最大吸收波長分別移動至279 nm和280 nm，說明成功形成了三元共價復合物。

從圖2可以看出，當激發波長為280 nm時，WP?在333 nm（

由圖3可以看出，WP?在3 273（酰胺A帶，代表N—H伸縮和氫鍵）、1 628 cm-1 （酰胺?帶）和1 533 cm-1 （酰胺??帶）。1 450 cm-1 附近的特征峰歸屬于酰氨基-???或C—NH2 伸縮振動。在GG紅外光譜曲線中，3 500～3 200 cm-1 處存在較寬的O—H吸收峰，1 606 cm-1 和1 408 cm-1 處的特征條帶是由COO—不對稱及對稱伸縮振動引起的；在2 932 cm-1 和1 028 cm-1cm-1 處觀察到CH2 和羥基C—O的伸縮振動。TP在3 258 cm-1 處有一處特征峰，來自酚羥基的振動收縮。

酰胺?和??帶是蛋白質的特征條帶，只受蛋白質二級結構的影響，可以用來判定蛋白質的結構變化。在WP?-GG和WP?-TP吸收光譜中，酰胺?和??帶的形狀和位置均發生變化，表明蛋白質二級構象發生變化。WP?-GG光譜中N—H伸縮和氫鍵吸收峰從3 273 cm-1 移動至3 279 cm-1 ，酰胺??帶從1 533 cm-1 移動至1 531 cm-1 并明顯增強，在1 028 cm-1 處，WP?-GG的吸收強度明顯高于天然GG，這表明在WP?-GG中產生了新形成的C—N共價鍵。WP?-TP光譜中酰胺A帶從3 273 cm-1 偏移至3 283 cm-1 ，酰胺?帶從1 628 cm-1 ，移動至1 635 cm-1，酰胺??帶從1 533 cm-1 移動至1 536 cm-1，表明TP與WP?的共價結合導致WP?的二級結構發生變化，可能與蛋白質中的—NH2 與TP的酚環之間的共價相互作用有關。

與WP?相比，三元共價復合物的酰胺A帶吸收峰強度增加，說明共價結合導致羥基數量增加。WP?GG-TP與WP?-TP-GG的酰胺?、??帶分別于1 607 cm-1 與1 605 cm-1 處合并成新峰，對比不同接枝順序發現共價TP對WP? 的三級結構影響更大，該結果與熒光結果一致。

02

ACNs納米顆粒的性能分析

2.1 粒徑與電位、負載率

由表1可知，WP?-GG-TP的平均粒徑與WP?-TPGG的粒徑相近，說明接枝順序對總體結構影響不大。WP?-GG-TP電位絕對值高于WP?-TP-GG，可能的原因是WP?-GG-TP的共價接枝提高了蛋白質的空間斥力，說明先接枝GG形成的溶液更加穩定。先接枝TP復合物的電位的絕對值低于先接枝GG，這是由于TP中和了WP?的部分正電荷基團，使更多的羥基引入蛋白質分子中，增加了蛋白質的負電荷。不同接枝順序的2 個三元共價復合物負載ACNs后粒徑大小存在顯著差異（

P

2.2 差示掃描量熱分析

如圖4所示，WP?、GG、TP、ACNs的熱吸收峰溫度分別為50.24、48.43、48.41、54.40 ℃。與WP?相比，三元復合物的熱峰溫度提高3.5～4.4 ℃，說明三元共價復合物的形成導致蛋白質的熱變性溫度升高，這有助于提高產品中WP?的熱穩定性。這與GG的空間位阻對蛋白質肽鏈伸展的影響有關。WP?-TP-GG-ACNs的熱峰溫度相較于ACNs提高了2.51 ℃，說明先接枝TP的三元共價復合物能夠更好地提高ACNs的熱穩定性。

2.3 抗氧化性

如圖5所示，ACNs的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和鐵還原力分別為52.78%、16.06%、0.550，WP?GG-TP-ACNs和WP?-TP-GG-ACNs的DPPH自由基清除率分別為82.40%和75.76%，與ACNs相比提高了29.62%和22.98%；羥自由基清除率分別為55.50%和72.02%，與ACNs相比提高了39.44%和55.96%；鐵還原力分別為1.230和1.321，與ACNs相比提高了1.24 倍和1.4 倍。3 種方法測定ACNs納米顆粒的抗氧化性均顯著高于單獨的ACNs，說明ACNs納米顆粒具有優良的抗氧化活性，這是因為ACNs以游離態存在時，極易受到外界光照、溫度等的影響而發生降解，導致抗氧化性降低，而將其包埋于納米復合物中，可減少ACNs與外界因素的接觸，避免產生分解等不良反應，而保護了ACNs的抗氧化能力。其次，多酚的結構中具有酚羥基，也具抗氧化作用。WP?-TP-GG-ACNs和WP?-GG-TP-ACNs的DPPH自由基清除率和鐵還原力無顯著性差異，而WP?-TP-GG-ACNs的羥自由基清除率顯著高于WP?-GG-TP-ACNs，可能是由于共價TP可以增加復合物的質子給予體和電子供體，從而顯著提高復合物的抗氧化活性，但是先接枝GG導致多糖的空間位阻作用阻礙了多酚與蛋白質的接枝，并且使得WP?-GG-TP-ACNs復合物體系的羥自由基清除率較WP?-TP-GG-ACNs低。

2.4 pH值穩定性

從圖6可以看出，當pH值為3或11時，ACNs的粒徑明顯大于pH 7時，而ACNs納米顆粒在不同pH值條件下變化幅度較小，性質相對穩定，可能是多糖的共價交聯形成的空間位阻作用所致。從PD?值也可以看出，pH值為3或11時，ACNs納米顆粒的PD?值均小于ACNs，說明ACNs納米顆粒的分布較為均勻。從Zeta電位可以看出，當pH值為11時，ACNs納米顆粒的Zeta電位突然增加，可能的原因是蛋白質和多糖上的羧基解離，釋放出更多的負電荷，負電荷累積在顆粒表面，導致Zeta電位增加。與游離ACNs相比，ACNs納米顆粒在pH值為11時粒徑較低，Zeta電位絕對值更高，具有更好的穩定性。

2.5 熱穩定性

如圖7所示，80 ℃加熱20、40、60、90、120 min和150 min后，ACNs的保留率分別為13.3%、12.8%、12.3%、11.9%、10.2%和9.3%。加熱20 min以內ACNs的保留率變化極大，這是ACNs沒有受到保護作用而發生了降解，當ACNs被負載在三元復合物中時，加熱后ACNs的保留率明顯得到較大提升，如在20 min時，WP?GG-TP-ACNs和WP?-TP-GG-ACNs的保留率分別提高了50.5%和59.9%，說明三元復合物能明顯提高ACNs的熱穩定性。ACNs納米顆粒的熱穩定性大小為：WP?-TP-GGACNs＞WP?-GG-TP-ACNs，可能的原因是GG在共價連接中起到一定的空間排斥作用，阻礙了ACNs的聚集，而先接枝TP由于酚羥基等活性基團與其他基團較強的相互作用，阻止了蛋白質的展開，為后接枝GG提供了更穩固的基礎。這一結果與ACNs納米顆粒差示掃描量熱分析結果一致。

2.6 儲存穩定性

如圖8所示，4 ℃避光儲存1、5、10、30 d后，ACNs的保留率分別為12.2%、11.1%、11.1%、10.4%。當ACNs被負載在三元復合物中時，保留率均有明顯提高，如在第10天時，WP?-GG-TP-ACNs和WP?-TP-GG-ACNs的保留率分別提高了48.9%和46.1%，這是因為WP?所形成的蛋白質保護膜與GG形成的網絡結構，共同為ACNs提供了保護屏障，使其不易受外界環境的干擾，三元復合物具有良好的抗氧化性能，從而減少ACNs的降解和損失。ACNs納米顆粒的儲存穩定性大小為：WP?-GG-TP-ACNs＞WP?-TP-GG-ACNs，可能與WP?先與GG的凝膠網絡結合，易形成更加緊密且穩定的復合物結構，共同起到對ACNs的保護作用。

03

結論

本實驗基于美拉德接枝法和堿處理法以不同接枝順序制備三元共價復合物（WP?-GG-TP和WP?-TP-GG），一系列結構表征表明復合物WP?-GG-TP和WP?-TP-GG之間產生了共價結合。使用三元共價復合物負載ACNs，先接枝GG的WP?-GG-TP-ACNs負載率為21.80%，而先接枝TP的WP?-TP-GG-ACNs負載率為18.68%。抗氧化和穩定性實驗結果表明，與游離ACNs相比，先接枝GG的三元復合物負載ACNs后，DPPH自由基清除率提高了29.62%，熱穩定性提高了50.5%，儲存穩定性提高了48.9%。而先接枝TP的三元復合物負載ACNs后，羥自由基清除率提高了55.96%，鐵還原力提高了1.4 倍，熱穩定性提高了59.9%，儲存穩定性提高了46.1%。

綜上所示，在制備三元共價復合物遞送ACNs時，若追求更高的抗氧化性及熱穩定性推薦優先接枝多酚，而追求更高的儲存穩定性推薦優先接枝多糖。本研究結果為研究食品級共價復合物對生物活性物質性能的提升提供更多的遞送載體種類選擇，同時為遞送載體的接枝順序影響提供參考。

本文《不同接枝順序三元共價復合物對藍莓花青素的穩態作用》來源于《食品科學》2025年46卷第6期73-79頁，作者：周 欣，黃金路，陳夢琳，馮論益，朱桂蘭*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241016-095。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。

實習編輯：梁雯菁；責任編輯：張睿梅。點擊下方 閱讀原文 即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網