FSHW | 組織蛋白酶B的構象變化對金華火腿NaCl還原可行性評價的研究

本文系Food Science and Human Wellness原創編譯，歡迎分享，轉載請授權。

Introduction

金華火腿的加鹽腌制過程非常重要，接著會進行洗滌、風干、成熟和后熟等多個步驟。雖然隨著科技的發展和經驗的積累，金華火腿的現代化生產在近年來取得了很大的進步。但是，它與意大利的Parma火腿、西班牙的Iberian火腿和Serrano火腿相比，仍存在一定差距。它們之間一個重要的區別是，意大利火腿和西班牙火腿可以生吃切片，這意味著消費者可以直接享用這些火腿，無需再經過烹飪或加熱。這極大地增強了火腿的便利性和食用性，使消費者能夠隨時品嘗到美味。相比之下，金華火腿的鹽分含量較高，通常需要經過一定的烹調或加熱才能食用。金華火腿的鹽含量約為12%，而帕爾馬火腿為4.2%～6.2%，伊比利亞火腿約為6.5%。高血壓患者需要謹慎選擇食用金華火腿或限制其食用量，因為過量的鈉攝入與增加血壓和心血管疾病風險有關。

在分子層面上，組織蛋白酶B的催化功能與其特定的空間結構密切相關，蛋白結構受到其所處環境條件的影響。溫度、pH值、鹽濃度等因素的變化都可能導致蛋白酶的結構發生改變，這些變化可能會影響酶的催化活性和功能。維持蛋白質空間結構的力包括疏水相互作用、范德華力、靜電相互作用和氫鍵。當某些二級結構發生變化時會引起蛋白質的構象變化，從而影響蛋白酶的生理功能或原有活性喪失。研究蛋白質的結構與功能之間的關系可以利用多種技術和方法，例如紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）、圓二色譜（circular dichroism，CD） 和熒光光譜等光譜技術是反映蛋白質在溶液中的構象變化、相互作用以及與其他分子之間的結合過程的強大工具。通過這些光譜技術，可以全面了解蛋白質的構象信息，并為蛋白質工程和藥物設計提供指導。分子動力學（molecular dynamics，MD）模擬是實驗方法的有效補充，可以模擬分子系統的靜態結構和動態行為。MD已被用于模擬不同溶劑中蛋白質大分子系統的動態變化，從真空中的小肽到分子間相互作用中的模擬。

目前，人們采用各種減鹽策略來控制金華火腿的腌制過程，如鹽替代品和各種無損技術。然而，這些方法的有效性在很大程度上取決于肉類產品的類型和配方，不適當的條件選擇可能導致不確定性和成本增加。先前的研究強調了組織蛋白酶B的活性以及NaCl在金華火腿加工過程中的重要性。然而，關于它們之間量化關系的研究相對較少，直接觀察NaCl 對組織蛋白酶B結構變化的研究也很少見。本文探討了不同NaCl濃度對組織蛋白酶B活性和構象變化的影響。首先對蛋白酶的二級和三級結構進行了表征，并采用分子對接和分子動力學模擬進一步研究。此外，還考慮到了溫度對NaCl濃度的相互作用。

Results and Discussion

紅外光譜分析

組織蛋白酶B在1540～1700 cm?1范圍內的光譜信號，可分為兩個區域：1600～1700 cm?1和1540～1600 cm?1。如圖1A所示，可以觀察到組織蛋白酶B的五個主要特征吸收峰。1610和1637 cm?1處的峰與-折疊結構相關，而位于1677 cm?1處的峰則對應于-轉角二級結構。此外，1650～1666 cm?1范圍與蛋白質的二級結構-螺旋密切相關。1553 cm?1處觀察到的峰主要對應于組織蛋白酶B的酰胺II帶，是由于蛋白質中N-H的彎曲振動所引起的。結合圖1B-C可以發現，隨著Na+陽離子的增加，組織蛋白酶B的構象發生改變。組織蛋白酶B的-折疊是在NaCl溶液中受影響最大的二級結構，宏觀上表現為酶活性的降低。

圖1 組織蛋白酶B在不同NaCl濃度下的紅外光譜圖

組織蛋白酶B的總巰基含量

從圖2A中可以看出，未經NaCl處理的組織蛋白酶B樣品與經過0.1 mol/L NaCl處理的樣品在總巰基含量上存在顯著差異（P＜0.05）。一旦NaCl的濃度超過0.1 mol/L，-SH含量從221.4 μmol/mg增加到224.3 μmol/mg。此后，隨著Na+濃度的增加，-SH含量減少，但其值仍高于未經NaCl處理的樣品。巰基含量數值增加的主要原因是NaCl影響了組織蛋白酶的結構，可能是蛋白質結構中原有的二硫鍵被破壞，或者掩埋在分子中的基團被釋放出來。此外，巰基是評估蛋白質氧化的有效指標。-SH含量的持續下降表明蛋白質發生了不可逆的氧化變性（0.1 mol/L NaCl濃度后）。如圖2A所示，當蛋白質位于逐漸增加的NaCl 濃度溶液中時，組織蛋白酶B更容易發生蛋白質變性。綜上所述，二硫鍵的斷裂和蛋白質的氧化變性是組織蛋白酶B酶活性下降的主要原因。

圖2 不同NaCl 濃度處理后組織蛋白酶B的總巰基含量和蛋白質表面疏水性的變化

組織蛋白酶B的表面疏水性

圖2B展示了不同NaCl濃度處理后的組織蛋白酶B表面疏水性的變化，當蛋白質的高級結構發生改變時，疏水側鏈將重新分布，表面疏水性相應發生改變。如圖所示，0、0.05、0.1、0.2和0.6 mol/L NaCl處理樣品的蛋白質表面疏水性分別為1124±2.64，1181.7±2.93，1135.4±3.58，1204.4±2.69和1217±1.52。未添加Na+離子的組織蛋白酶B溶液有著最低值，而鹽處理后蛋白質表面疏水性顯著增加（P＜0.05）。這可能與組織蛋白酶B的變性和空間結構的破壞有關。在自然狀態下，疏水基團被埋藏在分子內部，但添加了NaCl后，它們暴露于蛋白質的表面。蛋白質表面疏水性的增加是由于蛋白質發生變性和解折疊，如多肽鏈的擴張和一些疏水位點的暴露。圖2B中可以觀察到蛋白質表面疏水性的增加，這是由于蛋白質疏水基團所處的局部構象變得無序甚至受損，導致組織蛋白酶B展開和隱藏的疏水基團暴露出來。

Conclusion

NaCl抑制了組織蛋白酶B的活性，尤其是隨著鈉離子含量和溫度的增加，NaCl對蛋白酶的抑制效應更為顯著。隨著NaCl濃度的提高，組織蛋白酶B的二級和三級結構發生變化，具體表現為-螺旋含量減少，-折疊含量增加。構象變化的宏觀效應是組織蛋白酶B活性的降低。內源性熒光光譜和蛋白表面疏水性的結果與這一結論相符，NaCl的加入使得蛋白表面疏水性增加，色氨酸殘基暴露于微環境中。分子對接結果表明多肽底物Z-Arg-Arg-AMC通過氫鍵結合到組織蛋白酶B的蛋白質空腔中。另外，分子動力學模擬結果表示，在氯化鈉溶液中，組織蛋白酶B無法與底物形成穩定的催化體系，因此有著更高的RMSD值，RMSF值也發生了改變。在后續研究金華火腿降低鹽含量時，還需考慮加工溫度、處理時間、pH和氯化物替代物等因素的變化及相互作用。此外，還需要改進分子建模方法，進一步優化分子建模的細節，對火腿的減鹽研究具有重要意義。

第一作者

胡詩琪，女，工學博士，現為淮陰工學院生命科學與食品學院講師，主要研究方向為肉品加工與質量安全控制。目前主持江蘇省研究生科研與實踐創新計劃項目1項；參與國家自然科學基金面上項目2項，十三五國家重點研發項目2項，江蘇省重點研發項目及上海市科委地方能力建設項目各1項。在國內外期刊公開發表學術論文8篇，其中SCI收錄7篇，并擔任過國內外多個期刊的審稿人。

通信作者

周光宏，男，南京農業大學博導，教授，國際食品科學院院士，美國食品工程院院士，ISO肉禽魚蛋委員會主席，中國農學會副會長和中國食品科技學會副會長，長期從事肉品學研究與教學，是國家肉品質量安全控制工程技術研究中心主任和首席科學家。在肉與肉制品的品質形成機理、關鍵加工技術、標準與質量安全控制等方面取得諸多成果，主持完成的“冷卻肉品質控制關鍵技術”、“傳統肉制品品質形成機理及現代化生產”和“低溫肉制品質量控制關鍵技術”分別獲得國家科技進步二等和教育部科技進步一等獎；主編《畜產品加工學》、《肉品學》、《肉品加工學》等專著和教材，主持多項國際和國家肉品標準的制定，獲得發明專利30余項，發表論文200余篇，培養博士50余名。

Investigation of conformational changes of cathepsin B as a feasibility assessment for NaCl reduction in Jinhua ham

Shiqi Hua,b, Guanghong Zhoua,*, Xinglian Xua, Wangang Zhanga, Chunbao Lia

a Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Key Laboratory of Meat Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Jiangsu Synergetic Innovation Center of Meat Processing and Quality Control, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

b School of Life Science and Food Engineering, Huaiyin Institute of Technology, Huai’an 223003, China

*Corresponding author.

Abstract

To regulate the sodium chloride content in Jinhua ham, the impact of NaCl on the activity and conformation of cathepsin B was investigated using spectroscopy and computational methods. The results showed that the activity of cathepsin B decreased with an increase in Na+ cation content and temperature. Additionally, decreased α-helix content and increased β-sheet content were observed. The increase in sulfhydryl group content was attributed to the breaking of original disulfide bonds in the molecular structure or the release of embedded groups. Furthermore, the surface hydrophobicity gradually declined, which was consistent with the analysis of endogenous fluorescence spectroscopy. At the molecular level, the number of hydrogen bonds formed in NaCl-treated samples decreased, and the interactions between the hydrogen bonding were less powerful, which caused instability in the binding of the protein and substrate. The conformation of cathepsin B accurately characterized its activity, and the structural changes had a macroscopic effect on the decrease in protease activity.

Reference:

HU S Q, ZHOU G H, XU X L, et al. Investigation of conformational changes of cathepsin B as a feasibility assessment for NaCl reduction in Jinhua ham[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(2): 9250028. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250028.

本文編譯內容由作者提供

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創意

為進一步促進動物源食品科學理論的完善與創新，加速科研成果向實際生產力的轉化，助力產業實現高質量、可持續發展，由北京食品科學研究院、中國肉類食品綜合研究中心、中國食品雜志社將與江西農業大學、江西科技師范大學、 南昌師范學院、 家禽遺傳改良江西省重點實驗室 共同舉辦的“ 2025年動物源食品科學與人類健康國際研討會 ”，將于 2025年10月25-26日 在 中國 江西 南昌 召開。

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