APPS | 高壓滅菌處理調節蕓豆的致敏性：體外胃消化后的蛋白質組學與生物信息學見解

本文系Agricultural Products Processing and Storage原創編譯，歡迎分享，轉載請授權。

Abstract

紅蕓豆（Phaseolus vulgaris L.）作為一種營養豐富的豆類，其致敏性長期存在，這使其在食品應用中面臨顯著限制。本研究通過體外胃腸道消化模型，結合十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）、免疫印跡法及計算表位預測技術，評估了工業高壓滅菌（121 °C，15 min）對紅蕓豆致敏性調控的雙重作用。電泳圖譜分析顯示，主要過敏原（包括43 kDa菜豆素樣蛋白、凝集素亞基（31/25 kDa））發生部分降解。其中，豆球蛋白α亞基表現出胃蛋白酶抗性（穩定性達74.8%），而α-淀粉酶抑制劑（α-AI）和3組晚期胚胎富集蛋白（G3LEA）則快速降解。色譜免疫反應篩選結果表明，經高壓滅菌處理的樣品產生了8種抗原組分，其中包括具有增強免疫球蛋白E（IgE）結合潛力的新型疏水性肽段。質譜分析顯示，未處理（生豆）消化物和高壓滅菌處理消化物中分別鑒定出849和1516種獨特肽段，且處理后表位以菜豆素和凝集素為主。生物信息學分析突出顯示，菜豆素和凝集素中存在保守的致敏基序（如VLVKPIQIR、LPQQADAE），同時還存在具有同源性的交叉反應序列。矛盾的是，高壓滅菌雖降低了完整過敏原的含量，但通過表位的構象暴露及疏水性殘基富集，反而增加了免疫反應多樣性。這些研究結果強調，在豆類加工過程中，有必要進行表位特異性風險評估，以平衡熱加工干預的益處與潛在的意外致敏風險。

Introduction

隨著人們健康意識的不斷提升以及對均衡營養飲食的日益重視，作為優質健康蛋白質來源的植物基蛋白質，其需求正迅速增長。在眾多植物蛋白來源中，豆類因其豐富的營養成分而備受關注。紅蕓豆營養密度高，富含優質蛋白質、碳水化合物（包括膳食纖維）以及礦物質和維生素，這種營養特點使其在兼具主食與功能性配料雙重角色方面能提供全面的營養支持，進而推動其被廣泛應用于各類工業食品生產中，涵蓋罐頭制品、即食餐食及冷凍食品配方。值得注意的是，紅蕓豆具有出色的蛋白質生物利用率和成本效益，這使其成為新興植物基人造肉及低敏嬰兒營養食品中的核心配料，與全球向可持續蛋白質來源轉型的趨勢相契合。然而，致敏性問題是紅蕓豆食品生產中無法回避的重大挑戰。紅蕓豆持續存在的致敏性，仍是其在食品體系中安全應用的關鍵障礙。流行病學研究表明，在地中海地區人群中，蕓豆（此處特指紅蕓豆類）引發的過敏占兒童豆類過敏案例的80%；在土耳其豆類過敏兒童群體中，蕓豆更是主要過敏原，發病率高達66%。已有研究通過液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）技術發現，凝集素、菜豆素、α-AI及3組晚期胚胎富集蛋白（G3LEA）是紅蕓豆的主要過敏原。

在西方工業化國家，熱力加工和罐頭加工技術已成為豆類制品的主要保鮮方式。這種方法不僅能顯著延長保質期、提高物流效率，還符合當代消費者對便捷即食食品的偏好。在科學研究領域，工業高壓滅菌工藝（通常為121 ℃處理15 min）尤為受關注，該工藝會使蛋白質的致敏性發生顯著改變。以往研究表明，熱變性可通過改變致敏表位的結構，大幅降低其免疫反應潛力。具體而言，與未處理的紅蕓豆相比，經121 ℃、15 min熱處理后，紅蕓豆中的凝集素和胰蛋白酶抑制劑（二者均被認為是高致敏性成分）含量降低了40%～60%；并且，這些熱不穩定蛋白會因濕熱加工發生構象失活。

此外，當前的致敏性評估主要依賴純化的蛋白質分離物，卻嚴重忽視了抗原在胃腸道轉運過程中的蛋白水解重構。這種簡化的研究方法無法模擬調控蛋白質穩定性與免疫反應性的、具有區域特異性的生化環境。未被消化的蛋白質或其部分水解片段可能避開胃內降解過程，進而與腸道免疫監視機制相互作用，引發過敏反應。值得注意的是，盡管胃腸道蛋白酶會催化食物過敏原發生廣泛的蛋白水解，但具有抗性的免疫反應性表位在消化后仍能保留下來，且依舊具備交聯IgE受體、持續誘發Ⅰ型超敏反應的能力。這一發現表明，胃是調控口服耐受性的關鍵免疫檢查點：在該部位，消化效率是影響下游腸道抗原提呈細胞活化及輔助性T細胞2型（Th2）極化的決定性因素。

因此，本研究系統比較了未處理紅蕓豆（RKB）和高壓滅菌紅蕓豆（ARKB）在模擬胃消化后的體外致敏特征。研究采用SDS-PAGE、LC-MS/MS及免疫印跡法的多分析技術，對胃消化抗性肽的組成與穩定性進行表征。同時，利用授權線性B細胞表位預測工具（ILBE）和迭代B細胞表位構象集合學習工具（IBCE-EL）進行計算表位預測，以補充實驗數據，從而實現對殘留抗原決定簇的全面評估。這些方法共同揭示了高壓滅菌加工調控致敏風險的作用機制，為豆類加工行業優化食品安全規程建立了基于實證的理論框架。

Results and Discussion

RKB和及ARKB蛋白質的胃腸道穩定性電泳圖譜分析

在SDS-PAGE分析中，紅蕓豆蛋白質顯示出多種多肽亞基，分子量范圍為93～17 kDa。其中，主要亞基的分子量經鑒定分別為55、46～40、32和21 kDa。為減少SDS-PAGE成像中脫色偽影和背景干擾所導致的分析誤差，研究采用Quantity One軟件（v4.6.9）中的數學解卷積算法對蛋白條帶進行定量分析。該方法可精準區分6種不同的蛋白質條帶，其中43 kDa條帶（經鑒定為菜豆素）的相對豐度最高。

圖1 （A）RKB和（B）ARKB消化樣品中的蛋白質分布（Quantity One 軟件分析）

43 kDa菜豆素樣蛋白

盡管經過120 min的模擬胃腸道消化，RKB樣品中仍保留有19.8%的43 kDa蛋白（信號強度從180降至35.7強度單位）。ARKB樣品中該蛋白的殘留信號強度仍超過10%，這表明這種假定的菜豆素同源蛋白經熱加工后獲得了一定程度的熱穩定性。

凝集素亞基（31/25 kDa）

分子量為31和25 kDa的蛋白質對胃蛋白酶水解表現出極強的抗性。120 min后，31 kDa條帶的初始光密度（130 強度單位）降至62.1 強度單位，仍有52.3%的蛋白質保持完整。經鑒定，這些亞基是紅蕓豆凝集素的組成部分，在胃部環境中展現出固有的穩定性。對純化凝集素的對比實驗顯示，60 min時紅蕓豆凝集素仍保留56.5%，而黑豆凝集素僅保留12.94%。這種穩定性使得完整的凝集素能夠到達腸道上皮細胞，引發免疫介導的過敏反應。盡管高壓滅菌（95 ℃）可通過破壞凝集素的二級結構、暴露疏水性殘基及酶切位點，提高其對蛋白酶的敏感性，但本研究在消化后仍觀察到殘留的凝集素條帶。這種差異可能源于全豆體系與純化凝集素模型中的基質效應——在全豆體系中，熱誘導的聚集作用可能會遮蔽蛋白酶的識別位點。

豆球蛋白亞基（35～55 kDa-α亞基/21 kDa-β亞基）

豆球蛋白由通過二硫鍵連接的α亞基（35～55 kDa）和β亞基（21 kDa）組成，其消化性存在差異。在胃消化過程中，α亞基呈現出逐步積累的趨勢，在 120 min時達到峰值，這表明其具有胃蛋白酶抗性。相反，β亞基的信號強度從90.9 強度單位輕微降至68.0 強度單位，穩定性保持在74.8%。

α-AI與G3LEA的降解

α-AI是一種分子量為36 kDa的防御性蛋白，可抑制腸道淀粉酶活性；在模擬消化過程中，其對蛋白酶的抗性呈現劑量依賴性。對α-AI進行20 min高壓滅菌或5～10 min煮沸處理，可使其幾乎完全降解。與之不同的是，G3LEA（分子量50 kDa）的抗性極低：在RKB樣品中，該蛋白在5 s內即發生降解；而熱加工進一步加劇了其降解過程。

紅蕓豆消化肽的色譜圖譜分析與免疫反應性表征

如圖2所示，本研究采用反相高效液相色譜（reversed-phase HPLC）技術，對RKB和ARKB模擬胃腸道消化產生的肽段圖譜進行了系統分析。結果顯示，RKB與ARKB樣品的色譜圖譜存在明顯差異：在10.4～24.30 min的保留時間窗口內，RKB消化物呈現出8個清晰的色譜峰，而ARKB樣品在此區間內僅出現7個峰。值得注意的是，組分5在兩種處理組中均為優勢峰。此外，ARKB樣品在后期洗脫階段（24.37～70.00 min）表現出更強的異質性，具體特征為色譜峰形態不規則且基線噪音增加，這提示高壓滅菌處理更易生成疏水性肽段。洗脫圖譜的這種差異可能反映了熱加工引發的蛋白質結構修飾：高壓滅菌可能通過β-折疊結構變性和二硫鍵重排，破壞蛋白質的天然構象，從而使原本隱藏的酶切位點暴露于胃蛋白酶中。隨后，這些結構修飾后的蛋白質底物發生蛋白水解，可能生成疏水性特征改變的肽段群體，這與觀察到的后期色譜峰展寬現象一致。

圖2 RKB和ARKB抗消化肽的高效液相色譜（HPLC）分析與斑點印跡分析

紅蕓豆消化物免疫反應性篩選結果

為全面開展免疫反應性篩選，研究根據峰分離標準，分別從RKB消化物和ARKB消化物中收集到14和13個色譜組分，分別記為RKB組分（F1-F14）和ARKB組分（C1～C13）。RKB組分表現出選擇性免疫反應性：與陽性對照（F15）相比，組分F2、F4、F10和F11呈現陽性雜交信號（圖2C）。定量光密度分析顯示，F2和F4是主要的免疫優勢組分。這種優先的抗體結合作用與早期洗脫組分（F2、F4）中親水性表位的存在相關，提示水溶性可增強過敏原與抗體的相互作用。ARKB樣品則表現出更廣泛的免疫反應多樣性：相較于對照（C14），共鑒定出8個陽性組分（C1、C2、C4、C5、C7、C11、C12、C13）（圖2D）。晚期洗脫反應組分（C11、C12、C13）的出現表明，熱加工可產生新的抗原基序。RKB與ARKB樣品免疫反應性圖譜的差異（分別為4個和8個反應組分）從定量角度證明，盡管高壓滅菌降低了完整蛋白質的含量，卻反而反常地提高了致敏潛力。

免疫反應性肽段的質譜表征

對斑點印跡陽性的樣品組分進行質譜（MS）分析，結果如圖S2所示。在RKB的斑點印跡陽性樣品中，共檢測到61個（F2組分）、185個（F4組分）、186個（F10組分）和467個（F11組分）消化肽段。整合所有質譜數據并去除重復肽段后，共鑒定出849個獨特肽段。排除未知蛋白來源的條帶后，肽段數量最多的來源是3組晚期胚胎富集蛋白（G3LEA），共28個肽段（占總數的3.3%）；其次是含蛋白激酶結構域的蛋白（23個肽段，占2.3%）、菜豆素類蛋白（15個肽段，占1.8%）；含Cupin 1型結構域的蛋白和脂氧合酶各貢獻13個肽段。此外，豆球蛋白來源的肽段有10個，甘露糖凝集素FRIL（Flt3受體相互作用凝集素）來源的肽段有9個，菜豆紅細胞凝集素（PHA-E）和菜豆白細胞凝集素（PHA-L）分別貢獻2和5個多肽片段。同時，還鑒定出1個與α-AI相關的肽段（圖3A、B）。

圖3 RKB（共849 條肽段信息）和ARKB（共1516 條肽段信息）中抗消化陽性肽的分布

ARKB樣品的質譜分析結果

在ARKB樣品中，通過MS鑒定出2077條消化多肽序列（圖S3、S4）。去除重復序列后，共獲得1516個獨特多肽片段，這些片段分布在不同組分中。其中，菜豆素來源的肽段含量最高（54個，占總數的3.6%）；PHA-E和PHA-L各貢獻11個肽段；豆球蛋白貢獻19個肽段（占1.3%）；含激酶結構域的蛋白貢獻12個肽段（ 0.8%）；而G3LEA來源的肽段則減少至8個（占總數的0.5%）（圖3C、D）。

引發陽性過敏反應組分中肽段條帶的分布差異

在引發陽性過敏反應的組分中，RKB與ARKB的肽段條帶分布存在差異。在RKB樣品中，G3LEA來源的肽段含量最高（28個片段，占比3.3%），而在ARKB樣品中該類肽段減少至8個（占比0.5%）。這種減少可能是因為RKB中的G3LEA對胃蛋白酶水解的抗性較低，經高壓滅菌處理后更易發生降解。在ARKB樣品中，菜豆素是主要的多肽來源（占比3.6%），高于RKB樣品中的占比（1.9%），這可能是由于加熱降低了菜豆素對胃蛋白酶消化的抗性。含激酶結構域的肽段占比從2.3%降至0.8%，而豆球蛋白片段占比相對穩定（1.17%～0.90%），這表明豆球蛋白對胃蛋白酶水解和高壓滅菌處理均具有抗性。此外，加熱使凝集素來源的肽段占比從0.08%提升至1.1%，且凝集素衍生肽段的數量從RKB樣品中的7個增加至ARKB樣品中的22個。因此，這種系統性分析可能表明，熱加工是一把“雙刃劍”：雖能降低菜豆素的致敏性（積極作用，+），但可能會增加凝集素相關的致敏風險（消極作用，–）。

質譜鑒定致敏肽來源的生物信息學分析

對斑點印跡陽性樣品組分中肽段的氨基酸組成分析顯示出明顯趨勢。值得注意的是，在C13組分中僅鑒定出2個抗消化肽段（GINANNNNR和IGRALDGKDVL）；由于樣品量有限，這兩個肽段未納入氨基酸組成分析（表1、表2）。

表1 RKB體外模擬消化樣品中血清結合肽的氨基酸組成特征

表2 ARKB體外模擬消化樣品中血清結合肽的氨基酸組成特征

在RKB樣品中，消化肽段的主要氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸和谷氨酸，其含量均≥8%。疏水性氨基酸占總殘基的48.5%～49.4%。值得注意的是，半胱氨酸和色氨酸的含量與HPLC峰時間呈負相關。此外，還觀察到帶負電荷與帶正電荷殘基的分布較為均衡。與之相反，在ARKB樣品中，甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、谷氨酸和亮氨酸共占總殘基的48.7%。與RKB 樣品相比，ARKB樣品中疏水性氨基酸含量顯著增加，范圍為49.7%～54.2%，這表明其結構穩定性有所增強。蛋氨酸和半胱氨酸，在樣品中含量相對較低。同時，包括天冬氨酸/天冬酰胺、谷氨酸/谷氨酰胺在內的酸性氨基酸，其含量變化極小。

在RKB和ARKB樣品中，親水/疏水殘基比例均衡且賴氨酸含量較高，這可能表明肽段具有構象穩定性，從而能夠與抗體發生相互作用。高壓滅菌處理減少了抗胃蛋白酶水解的肽段（如G3LEA、α-AI），這可能是蛋白質變性所致；但與此同時，菜豆素中疏水基團的暴露增加，使其消化率提高，且抗原性肽段釋放量增加。表3～6分別列出了菜豆素、凝集素、α-AI、G3LEA和豆球蛋白的抗消化肽序列。研究通過IBCE-EL和ILBE在線服務器，對抗消化肽作為抗原表位的潛力進行了分析；當且僅當兩個服務器均預測某一肽段為抗原表位時，該肽段才可被視為菜豆蛋白的潛在致敏肽。

表3 紅蕓豆消化產物中菜豆蛋白相關免疫反應肽的HPLC-MS/MS分析及抗原性預測

表4 紅蕓豆消化產物中凝集素相關免疫反應肽的HPLC-MS/MS分析及抗原性預測

表5 紅蕓豆消化產物中G3LEA相關免疫反應肽的HPLC-MS/MS分析及抗原性預測

表6 紅蕓豆消化產物中豆球蛋白相關免疫反應肽的HPLC-MS/MS分析及抗原性預測

Conclusion

本研究系統探究了高壓滅菌處理對紅蕓豆蛋白質致敏性及消化性的影響。結果表明，高壓滅菌可顯著降低G3LEA、α-AI等熱不穩定型致敏原在胃中的殘留量。然而，這種緩解效應被凝集素亞基及菜豆素同源蛋白增強的抗酶解性所抵消——消化后這些蛋白仍保留了超過10%的殘留免疫反應性。熱力處理過程中疏水性殘基的暴露及蛋白質結構重排，可能破壞了蛋白質的天然構象，反而反常地增加了ARKB樣品的抗原多樣性。值得注意的是，高壓滅菌后凝集素衍生肽段含量增加，而菜豆素片段在致敏圖譜中占主導地位，這凸顯了它們作為熱穩定表位的作用。質譜與生物信息學分析進一步揭示，菜豆素衍生基序（如VLVKPIQIR、LPQQADAE）及凝集素表位（VGSEPKDKGG、LQRDATVSS）與其他豆類同源致敏原存在交叉反應性，且豆球蛋白亞基含有與花生球蛋白相似的IgE結合基序。這些研究結果闡明了熱力加工在緩解與加劇致敏風險中的雙重作用，強調需通過精準食品工程技術在保留營養與降低致敏原含量之間實現平衡。未來研究應優先采用結構疫苗學方法，開發低致敏性豆類品種，同時維持其營養完整性。

Autoclave processing modulates allergenic potential of red kidney beans (Phaseolus vulgaris L.): proteomic and bioinformatics insights after in vitro gastric digestion

Rong Zhang1?, Kailin Feng1?, Yongfei Wang1?, Shudong He1*, Sophia Xue1, Xinping Qian1, John Shi2*

1 School of Food and Biological Engineering, Engineering Research Center of Bio-Process of Ministry of Education, Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province, Hefei University of Technology, Hefei, 230009, China

2 Guelph Research and Development Center, Agriculture and Agri-Food Canada, Guelph, ON, N1G 5C9, Canada

? Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Red kidney beans (Phaseolus vulgaris L.), a nutrient-dense legume, face significant limitations in food applications due to persistent allergenicity. The dual effects of industrial autoclaving (121 °C, 15 min) on allergenicity modulation were evaluated through in vitro gastrointestinal digestion models in this study, integrated with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS), immunoblotting, and computational epitope prediction. Electrophoretic profiling demonstrated partial degradation of major allergens for 43 kDa phaseollin-like protein, lectin subunits (31/25 kDa). Legumin α-subunits exhibited pepsin resistance (74.8% stability), contrasting with rapid degradation of α-amylase inhibitor (α-AI) and group 3 late embryogenesis abundance (G3LEA) proteins. Chromatographic immunoreactivity screening revealed autoclaved samples generated 8 antigenic fractions, including novel hydrophobic peptides with enhanced immunoglobulin E (IgE)-binding potential. Mass spectrometry identified 849 and 1 516 unique peptides in raw and autoclaved digests, respectively, with phaseollin and lectins dominating post-processing epitopes. Bioinformatics highlighted conserved allergenic motifs (e.g., VLVKPIQIR, LPQQADAE) in phaseollin and lectins, alongside cross-reactive sequences homologous. Paradoxically, autoclaving reduced intact allergen content but amplified immunoreactive diversity through conformational exposure of epitopes and hydrophobic residue enrichment. These findings underscore the necessity for epitope-specific risk assessment in legume processing, balancing benefits of thermal intervention against unintended allergenic consequences.

Reference:

Zhang, R., Feng, K., Wang, Y. et al. Autoclave processing modulates allergenic potential of red kidney beans (Phaseolus vulgaris L.): proteomic and bioinformatics insights after in vitro gastric digestion. Agric. Prod. Process. Sto. 1, 18 (2025). https://doi.org/10.1007/s44462-025-00018-4

翻譯：王立磊（實習）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片來源：圖蟲創意

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