《食品科學》：華南農業大學劉曉娟教授：全反式和順式蝦青素對胰腺α-淀粉酶的抑制效果差異及其機制

蝦青素是一種含氧類胡蘿卜素，分子結構有一條長共軛雙鍵鏈，鏈兩端各連接一個含有羥基和酮基的

胰腺

華南農業大學食品學院的鄒曉君、鄭欽生、劉曉娟*等人旨在探究全反式和順式蝦青素對PPAA的抑制效果及其作用機制。通過酶活性抑制實驗、光譜技術和MD技術分析蝦青素對PPAA構象的影響、與PPAA的結合位點、熒光猝滅機制、結合常數和熱力學參數。研究結果有助于揭示蝦青素異構體的降血糖活性差異和潛在機制，對于開發降血糖的新型功能性食品和藥品具有重要的應用價值。

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順式蝦青素的制備和鑒定

光碘異構化是實現蝦青素順式轉化的有效手段。全反式蝦青素光碘順式轉化后，采用HPLC對異構化后產物進行檢測，結果如圖2A、B所示。異構化后的蝦青素含有3 個主要吸收峰，其中2號和3號峰是新產生的。經過乙醇提純后，2號和3號峰樣品相對含量顯著增加，分別由23.18%和21.43%上升至24.49%和44.02%。1號峰樣品含量下降，附近還出現了其他峰，可能在異構化過程中有其他副產物的形成。根據課題組前期研究結果對這3 個峰的保留時間進行初步判斷得出，1號峰樣品為全反式蝦青素，2號峰樣品為9-順式蝦青素，3號峰樣品為13-順式蝦青素。

為了進一步明確這些異構體的構型，本研究借鑒經典的Q值計算法判定順式異構體，Q值是目前公認的一種快速、簡便的判定順式構型的方法。順式異構體由于其分子結構中雙鍵的彎曲，會在300～400 nm范圍內產生一個額外的吸收峰，這個峰稱為順式峰，全反式異構體則只有一個主吸收峰。順式峰的吸光度與主峰吸光度的比值被定義為Q值，根據Q值大小判斷蝦青素發生異構的位點。使用HPLC-二極管陣列檢測器收集各峰的電子吸收光譜，并據此計算Q值。如圖2C所示，1號全反式蝦青素峰只在480 nm附近出現一個主峰，2號峰樣品除主峰外，還在350～400 nm處出現一個吸收峰（順式峰），表明2號峰樣品是順式蝦青素。此外，相比全反式蝦青素下凹的形狀，3號峰樣品在350～400 nm處表現出一個不明顯的峰型。將1～3號峰樣品的主峰和順式峰的響應值進行計算，得到Q值分別為0.11、0.21和0.63。基于Q值越大表明異構化發生在C鏈中間的概率越大，再結合蝦青素異構體的分子結構看，確定1～3號峰樣品分別為全反式、9-順式和13-順式蝦青素。

接著通過硅膠柱層析進行分離純化。如圖3A所示，在過柱分離過程中產生了3 個色帶，將它們分開收集，并通過TLC進行初步鑒定。如圖3B所示，薄層板上顯示含有3 種主要的物質，它們與順式蝦青素混合物（參比）的斑點有很好的對應性，并且3 種物質逐漸被洗脫出來，有較好的分離度。根據點板結果，將1～3號（1號色帶）、5～7號（2號色帶）、11～18號（3號色帶）斑點分別合并后用HPLC鑒定蝦青素構型和純度。如圖3C所示，1、2和3號色帶分別對應全反式、9-順式和13-順式蝦青素，并且9-順式和13-順式蝦青素樣品純度分別達到95.07%和90.87%。由此可見，本研究建立的光碘異構實現了順式蝦青素的快速轉化，乙醇提取利用了蝦青素順式和全反式溶解度的顯著差異富集順式構型，硅膠柱層析和薄層層析的優化條件實現了9-順式和13-順式的有效分離。高純度的順式蝦青素為后續研究提供了原料支持。

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全反式和順式蝦青素對PPAA活性的抑制作用

酶活性抑制實驗是評估化合物對特定酶功能影響的重要方法，它能夠直接觀察和量化蝦青素異構體對PPAA活性的抑制效果。通過測定不同質量濃度下蝦青素幾何異構體對PPAA活性的影響，可以評估它們作為天然酶抑制劑的潛力，這對于開發新型降血糖藥物和功能性食品具有重要意義。如圖4所示，在10.00、15.00 μg/mL和50.00 μg/mL質量濃度下蝦青素幾何異構體對PPAA都有明顯的抑制效果，并且呈現濃度依賴性。當蝦青素質量濃度為10.00 μg/mL時，全反式、9-順式和13-順式蝦青素對PPAA的抑制率分別為9.59%、11.35%和10.95%，其中9-順式與全反式蝦青素具有顯著差異（P＜0.05）；當蝦青素質量濃度增加到50.00 μg/mL時，它們的抑制率分別達到51.13%、62.57%和61.55%，9-順式、13-順式與全反式蝦青素均表現出顯著差異（P＜0.05）。因此，本實驗表明順式蝦青素相比全反式蝦青素具有更顯著的PPAA抑制效果，這為開發高效降血糖活性成分開辟新思路。

天然活性物異構體尤其是蝦青素的功效逐漸成為近些年的研究熱點，如陳曉楓發現不同幾何構型蝦青素抗氧化和延緩衰老活性大小順序為：9-順式＞全反式＞13-順式，研究進一步揭示了其在抗氧化和延緩衰老機制上存在差異；Liu Xuebo等發現順式蝦青素特別是9-順式異構體在抑制細胞氧化應激和炎癥反應方面比全反式蝦青素更有效。此外，9-順式還顯示出對人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中6-羥基多巴胺誘導的活性氧生成的最有效抑制，以及對蝦皮素誘導的II型膠原降解的最有效抑制。由于6-羥基多巴胺誘導的SH-SY5Y細胞模型與帕金森病的病理機制相關，9-順式蝦青素的這種抑制作用可能為帕金森病的治療提供新的策略。這些研究體現出順式蝦青素介導了更優異的健康效應，然而通過聚焦功能酶的角度來闡明蝦青素異構體活性差異機制有待進一步探索。

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全反式和順式蝦青素對PPAA構象的影響

根據抑制劑與酶結合的特點可將抑制類型分為不可逆抑制和可逆抑制兩種，其中大多數抑制類型都為可逆性抑制。可逆抑制類型又可分為4 類，分別為競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制、混合型抑制。競爭性抑制是指抑制劑在與底物相同的結合位點與酶結合，可逆地阻斷底物分子被酶水解；非競爭性抑制則是在與底物不同的結合位點與游離酶或酶-底物復合物結合，破壞酶的構象使其失活；反競爭性抑制中抑制劑僅在底物已經與酶結合后，才能與酶結合，形成酶-底物-抑制劑復合物，阻止產物的形成。混合型抑制則結合了競爭性抑制和非競爭性抑制的特點，既能與游離酶結合也能與酶-底物復合物相互作用。為了探究蝦青素異構體抑制PPAA活性的作用機制，首先采用CD和SFES分析相互作用對PPAA構象的影響。

如圖5和表1所示，天然PPAA在207 nm處出現一個最低的波谷，通過軟件計算得到其二級結構為7.57% α-螺旋、43.40% β-折疊、20.17% β-轉角和36.40%無規卷曲，表明PPAA的二級結構主要是β-折疊，這與前人的研究結果一致。當PPAA結合了蝦青素幾何異構體后，其CD光譜出現波動并發生輕微上升，對二級結構中的β-折疊相對含量產生微弱的影響，其在全反式、9-順式和13-順式蝦青素中分別提高到43.83%、43.73%和43.87%，它們都不存在顯著性差異（P＞0.05）。這種現象表明全反式和順式蝦青素與PPAA的結合不會對蛋白二級結構造成明顯改變，有助于PPAA維持其原有的生理功能。

進一步，通過SFES觀察蝦青素幾何異構體是否會對PPAA微環境造成影響，依據光譜中最大發射波長位置的變化反映相互作用對生色氨基酸（Trp、Tyr、Phe）周圍環境極性的影響。當激發波長和發射波長的波長間隔?λ固定為15 nm或60 nm時，可以分別獲得酪氨酸（Tyr）或色氨酸（Trp）殘基的微環境信息。如圖6所示，Tyr和Trp殘基分別在296 nm和340 nm處出現最大發射波長。隨著全反式、9-順式和13-順式蝦青素的加入，Trp殘基的最大發射波長均發生了微弱的位移（1 nm以內），而對Tyr殘基微環境沒有影響，表明蝦青素幾何異構體的結合位點可能位于Trp附近。由此可見，蝦青素幾何異構體與PPAA的相互作用不會顯著影響PPAA的微環境。

CD和SFES的結果表明，蝦青素幾何異構體與PPAA的相互作用并未引起蛋白質構象的顯著變化。考慮到在混合或非競爭性抑制機制中，酶的構象通常會被破壞。并且在無底物淀粉存在的情況下，蝦青素幾何異構體已經存在與PPAA的相互作用，排除了反競爭性抑制的可能。基于此，推測蝦青素幾何異構體是通過競爭性抑制機制降低PPAA活性，發揮降血糖效應。這一假設與先前全反式蝦青素作為α-葡萄糖苷酶競爭性抑制劑的報道一致。因此接下來對蝦青素幾何異構體與PPAA的相互作用進行驗證，以進一步支持這一假設。

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全反式和順式蝦青素與PPAA的模擬結合

MD是預測和可視化小分子-蛋白質相互作用的重要工具。通常，低于－5 kcal/mol的結合能被認為結合相對穩定。本研究利用MD模擬探索蝦青素異構體與PPAA的結合位點，并與PPAA的特異性抑制劑（阿卡波糖）進行對比分析，為PPAA與蝦青素異構體的相互作用機制提供更深入的了解，對接結果如圖7所示。

如表2所示，PPAA與全反式、9-順式和13-順式蝦青素的結合自由能分別為－9.3、－10.0 kcal/mol和－9.9 kcal/mol，這些值明顯低于－5 kcal/mol閾值，說明結合相對穩定。值得注意的是，9-順式和13-順式蝦青素的結合自由能小于全反式蝦青素，結合自由能越低結合結構越穩定，說明順式蝦青素與PPAA的結合更穩定。此外，不同蝦青素幾何異構體的主要相互作用力都為范德華力、氫鍵和疏水作用力，并且均與Glu233殘基形成氫鍵，但順式蝦青素的氫鍵鍵長更短，暗示其可能具有更強的氫鍵作用力。與此同時，順式蝦青素比全反式蝦青素具有更多的互作氨基酸殘基。這是因為順式蝦青素與全反式蝦青素在結構上的關鍵區別在于分子鏈的形狀，它們分別表現為折疊和直線。折疊的形狀使順式蝦青素更充分地利用了酶催化中心的空間，而線性的形狀則使全反式蝦青素的結構更多地暴露在外面。因此，更多的氨基酸殘基將參與順式蝦青素的相互作用，這一結論在蝦青素與牛血清白蛋白的相互作用中也得到了印證。此外，Trp59殘基都參與了蝦青素幾何異構體與PPAA的相互作用，這可以解釋2.3節中Trp最大發射波長的輕微位移變化。

最優的對接模式顯示蝦青素幾何異構體都結合在PPAA的催化中心（圖7），并且結合位點較為相似。已知Asp197、Glu233和Asp300是酶催化中心的關鍵氨基酸殘基，它們都存在于蝦青素幾何異構體的互作氨基酸殘基中。進一步對比蝦青素幾何異構體和阿卡波糖的結合位點（圖7D），可以發現它們的結合位點十分相似。蝦青素作為脂溶性物質，由于具有“極性-非極性-極性”的線性結構，其與酶的結合過程可能是通過疏水相互作用擴散到酶分子內部的疏水腔中，并通過極性含氧基團（羥基和酮基）與酶的氨基酸殘基形成氫鍵。阿卡波糖作為水溶性物質，則通過羥基與酶活性中心內氨基酸殘基的極性基團形成氫鍵。因此，這可能解釋了二者與PPAA結合位點相似的現象。由于阿卡波糖可以競爭性地結合酶的催化中心進而起到抑制酶活性的作用，這在理論層面進一步證明蝦青素幾何異構體具有抑制PPAA活性的作用，并且抑制機理是競爭性結合酶的催化中心抑制酶活性，這一機理在其他的研究中也得到了印證。近期有研究表明，當卵黃高磷蛋白質量濃度高于1 mg/mL時對PPAA的抑制作用為競爭性抑制，其通過結合在PPAA的活性空腔中，競爭性結合底物的催化位點，進而降低PPAA活性。另有報道3 種黃酮類化合物蘆丁、槲皮素和山柰酚通過占據PPAA的主要活性位點，競爭性地阻礙底物進入，導致酶的催化活性降低。

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全反式和順式蝦青素與PPAA相互作用的熒光猝滅機制

熒光猝滅效應分析可用于觀察蝦青素與α-淀粉酶分子間結合的相互作用。PPAA內部含有17 個Trp殘基，由于Trp、Tyr和苯丙氨酸（Phe）等芳香族氨基酸存在，PPAA具有內源性熒光，熒光的強度和位置與這些芳香族氨基酸殘基所處的微環境密切相關。由于熒光團對周圍環境的極性很敏感，因此可通過IFES測定分子間相互作用信息。

如圖8所示，在加入蝦青素幾何異構體后，334 nm處的熒光發射峰明顯下降，并且表現出濃度依賴的猝滅效果，這表明蝦青素幾何異構體與PPAA發生相互作用導致蛋白熒光猝滅。與此同時，位于280 nm處的肽鏈熒光峰也隨著蝦青素質量濃度的增加而增強，表明二者的相互作用影響了蛋白質結構，但由于其最大發射波長沒有出現位移變化，因此推斷這種影響比較輕微，該結果與CD和SFES檢測效果吻合。

為了進一步闡明蝦青素幾何異構體和PPAA的熒光猝滅機制，采用Stern-Volmer方程（式（4））進行計算分析。如圖9所示，在不同溫度（298、310 K）條件下，熒光強度比（F0/F）與蝦青素幾何異構體質量濃度（[Q]）之間均呈現良好的線性關系，且決定系數R2值接近1，說明蝦青素幾何異構體猝滅α-淀粉酶的熒光過程中存在單一的猝滅機制。

據報道，熒光猝滅機制可分為靜態猝滅和動態猝滅以及兩者的結合。靜態猝滅涉及猝滅劑和熒光分子之間形成復合物。由于復合物在較高溫度下穩定性降低，所以Ksv隨溫度升高而降低。動態猝滅則是猝滅劑與熒光團擴散和碰撞的結果。由于擴散和碰撞事件的加劇，所以Ksv隨著溫度的升高而增大。由表3可以看出，全反式、9-順式和13-順式蝦青素的Ksv都隨著溫度升高而下降，且同種蝦青素（不同溫度）對α-淀粉酶的Ksv值與溫度之間呈顯著負相關（P＜0.05），上述結果表明蝦青素幾何異構體與PPAA發生結合時猝滅機制為靜態猝滅而不是動態猝滅。此外，3 種蝦青素異構體的雙分子猝滅速率常數Kq都遠高于生物分子的最大散射碰撞猝滅常數2.0×1010 L/（mol·s），再一次支持靜態猝滅機制的結果。這一現象與沒食子酸對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅過程為靜態熒光猝滅，而不是由分子碰撞引起的動態熒光猝滅類似。

綜上所述，熒光猝滅研究表明蝦青素幾何異構體與PPAA的相互作用引起了輕微的蛋白質結構變化，并且熒光猝滅機制為靜態猝滅。將對熒光強度進一步計算，通過分析結合常數和熱力學參數，進一步探究蝦青素幾何異構體與PPAA的相互作用中的結合模式和親和力，以深入揭示蝦青素異構體降血糖活性差異背后的分子機制。

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全反式和順式蝦青素與PPAA相互作用的結合常數和結合位點數

2.3節已經證明蝦青素異構體可以作為PPAA的抑制劑，并且發現蝦青素異構體表現出不同程度的抑制效果。為了探究它們作用差異的可能因素，使用雙對數方程（式（5））利用2.5節熒光強度進行計算，結果如圖10所示，按照線性截距和斜率分別代表結合常數KA和結合位點數量n進一步分析。

蝦青素幾何異構體表現出不同程度的結合親和力。在298 K時，9-順式和13-順式蝦青素具有較高且相近的結合常數（KA），分別為1.24×103 L/mol和1.35×103 L/mol，全反式蝦青素表現出最弱的結合常數，為6.05×102 L/mol，并且順式蝦青素與全反式蝦青素之間有顯著差異（P＜0.05，表4），表明順式蝦青素較全反式蝦青素對PPAA具有更強的結合親和力。這種結合親和力強弱的趨勢與酶活性抑制效果一致。李志鵬等研究2 種青稞多糖對PPAA的抑制作用和徐冬蘭等研究苦丁冬青苦丁茶咖啡酰奎尼酸類物質與PPAA的抑制作用也得到了相似的結果。此外，蝦青素-PPAA的n接近于1，表明蝦青素幾何異構體在PPAA中均只有一個結合位點。

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全反式和順式蝦青素與PPAA相互作用的熱力學參數和相互作用力

熱力學參數也是反映分子間相互作用的一個重要指標，蝦青素幾何異構體與PPAA結合模式的不同會導致它們在熱力學參數上表現出差異。此外，熱力學參數還是推斷相互作用力的重要依據，這有助于進一步了解它們的結合機制。因此使用式（6）、（7）分析2.5節中IFES的相互作用力。

Ross等根據大量實驗總結了水相中小分子與生物大分子結合的熱力學參數與主要作用力之間的關系：1）當ΔH＞0、ΔS＞0時，兩者間為疏水作用力；2）當ΔH＜0、ΔS＜0時，則為氫鍵和范德華力；3）當ΔH≈0、ΔS＞0，則為靜電引力。如表5所示，全反式、9-順式和13-順式蝦青素與PPAA相互作用的焓變?H分別為－70.02、－67.54 kJ/mol和－105.33 kJ/mol，熵變?S分別為－181.71、－167.43、－293.56 J/（moL·K）。蝦青素幾何異構體均呈現負值的?H和?S，表明驅使它們與PPAA發生結合的主要相互作用力是氫鍵和范德華力，這與MD所揭示的相互作用力類型高度一致。同時，13-順式蝦青素的?H和?S均小于全反式和9-順式蝦青素，它們熱力學參數的差異暗示13-順式蝦青素可能與更多的氨基酸殘基相互作用或具有更強的相互作用力，這也與MD中順式蝦青素比全反式蝦青素結合更穩定的結果相呼應。此外，結合過程中的ΔG小于0，表明蝦青素幾何異構體與α-淀粉酶之間的相互作用是自發進行的。并且，焓變對ΔG的負值起到了主要貢獻作用，說明該反應由焓驅動。

熱力學分析和MD的結果一致表明，蝦青素幾何異構體與PPAA之間的主要相互作用力為氫鍵和范德華力。與蝦青素不同的是，其他類胡蘿卜素如β-胡蘿卜素和番茄紅素與蛋白質的相互作用主要表現為疏水相互作用，因為它們的分子結構中缺乏含氧基團，阻礙了氫鍵的形成。蝦青素幾何異構體相同類型的相互作用力可歸因于它們相同的官能團，這表明蝦青素與PPAA相互作用力的形式不受異構體結構差異的影響。類似地，有學者通過熱力學分析得出，順式和反式Pt(NH3)2Cl2共軛物與殼聚糖納米顆粒的作用力類型均為親水和疏水作用。這一現象表明順反異構體雖有結構差異，但相互作用力類型可能不變，與本研究發現相契合。

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結 論

本實驗探討了蝦青素異構體對降血糖關鍵調控酶的抑制效果，通過光譜技術和MD技術從全反式和順式蝦青素與PPAA的結合力和結合模式角度，揭示了其抑制酶活能力的差異及其分子機制。順式蝦青素抑制PPAA活性能力顯著優于全反式構型，暗示其具有更強的降血糖活性。蝦青素異構體與PPAA的相互作用未對蛋白質構象帶來明顯改變，有助于PPAA維持其原有的生理功能。蝦青素異構體的結合位點均位于PPAA的催化口袋，與酶抑制劑阿卡波糖的結合位點相同，并且與酶催化中心的關鍵氨基酸殘基Asp197、Glu233和Asp300具有相互作用，表明蝦青素異構體對PPAA的抑制均為競爭性抑制。同時，蝦青素異構體與PPAA發生結合均為靜態猝滅。進一步揭示了不同蝦青素幾何異構體的主要相互作用力都為范德華力、氫鍵和疏水作用力，并且均與Glu233殘基形成氫鍵，但順式蝦青素的氫鍵鍵長更短，表明其具有更強的氫鍵作用力。與此同時，順式蝦青素比全反式蝦青素具有更高的結合親和力、更多的相互作用氨基酸殘基和更低的熱力學參數，再次表明其與PPAA具有更強的結合能力，使得順式蝦青素比全反式蝦青素具有更強的酶活性抑制效果。這些研究結果揭示了全反式和順式蝦青素對PPAA活性抑制能力的差異及其分子機制，不僅有助于探索蝦青素在調節血糖水平方面的應用潛力，而且對于理解蝦青素異構體活性差異的分子機制具有重要意義。后續還需進一步通過體內動物實驗和人體實驗來進一步揭示全反式和順式蝦青素的降血糖功效差異及其原因，以期為開發降血糖的新型功能性食品和藥品提供重要線索。

作者簡介

通信作者：

劉曉娟，華南農業大學食品學院副教授。2008年博士畢業于暨南大學。2015年7月至2016年7月，國家公派到美國馬薩諸塞州立大學（全美博士學科點食品排名第一）做訪問學者一年，主要從事食品功能因子活性評價及作用機理、食品生物化學與分子生物學、遞送體系提高活性物的生物利用率、功能食品研發等領域的研究工作。廣東省高等學校“千百十工程”校級培養對象，華南農業大學2020年“三育人”教書育人先進個人、華南農業大學“第一批卓越青年教師百人計劃、”華南農業大學“青年骨干教師”，廣東省企業科技特派員、農村科技特派員。在教學方面，系統講授《食品化學》、《功能食品學》等課程，負責省級一流（課程思政）本科課程；在科研方面，近年來，主持2項國家自然科學基金項目、1 項教育部博士點基金項目、4 項廣東省自然科學基金項目、1 項廣東省科技計劃項目、1 項廣州市重點研發項目、1 項廣州市科技計劃項目、1 項廣東省教育廳項目、5 項企業橫向課題等十多個項目，主要參與國家級、省市級各類項目30多項；以第一作者和通訊作者發表論文40多篇，其中SCI&EI收錄30多篇；申請國家發明專利6 項。

第一作者：

鄒曉君，華南農業大學在讀碩士研究生，研究方向為食品化學及功能性食品。

本文《全反式和順式蝦青素對胰腺α-淀粉酶的抑制效果差異及其機制》來源于《食品科學》2025年46卷第15期35-46頁，作者：鄒曉君，鄭欽生，趙凱欣，馮裕杰，肖 杰，賀麗蘋，曹 庸，劉曉娟*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250102-007.。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。

實習編輯：閆凱；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網