《食品科學》：西華大學邢亞閣教授等：青檸檬腐敗真菌分離鑒定及UV結合LED光誘導復合膜液對其抑菌效果

青檸檬（

Citrus aurantium

）是蕓香科柑橘屬小喬木，別名西檸檬、洋檸檬、益母果等，憑借獨特風味和豐富營養成為廣受青睞的食用水果。青檸檬因多汁且組織脆弱，在采后運輸及貯藏中極易產生機械損傷，導致病原菌通過傷口侵染，引發果肉轉黃、軟化凹陷及霉菌滋生，直至整顆果實全部腐爛變質，散發出刺鼻的霉味。

真菌病害是造成柑橘類果實在貯藏和運輸期間腐爛的最主要原因，包括意大利青霉（

Penicillium italicum

）引起的青霉病、指狀青霉（

P

digitatum

）引起的綠霉病、柑橘鏈格孢（

Alternaria citrus

）引起的黑腐病、膠孢炭疽菌（

Collectotrichum gloeosporioides

）引起的炭疽病。其中，青霉和綠霉病在真菌病害中尤為嚴重，也是青檸檬等柑橘類水果研究的痛點、難點和熱點。

近年來，可食性涂膜因其具有環境友好、安全性高的優勢，成為食品保鮮領域的研究熱點。殼聚糖（CTS）是一種天然陽離子堿性多糖，具有抑菌、抗氧化、可食用等特性，常被選為可食性涂膜的制備基材。然而，純CTS涂膜存在不均勻、抗菌能力一般等缺點，需與其他物質聯合使用，以改善涂膜表面粗糙度、增強抑菌效果。納米TiO2作為光催化材料，具有良好的熱穩定性且無毒，其抑菌機理是通過光催化作用，在紫外或可見光誘導下生成活性氧簇，破壞菌體細胞膜，導致細胞內容物外滲，出現菌體空殼現象。納米Ag粒徑約25 nm，能大面積接觸病原菌，且在可見光誘導下可被激發，其抑菌機理是利用其強烈穿透力，破壞細胞DNA結構，改變細胞壁和細胞膜的透過性，使菌體細胞代謝和繁殖功能受阻直至死亡。研究表明，納米TiO2與納米Ag可彌補純CTS涂膜的不足，且具有協同抗菌效果，將三者制成復合膜液可增強抑菌效果。此外，光催化納米TiO2能增強其抗菌能力，而納米Ag的添加則通過提高光吸收率、增加表面活性位點，進而擴大TiO2的光催化面積，提升其光催化性能。

西華大學食品與生物工程學院的楊路林、范湘鳳、邢亞閣*等研究以腐敗青檸檬果皮為分離源，分離并純化得到青檸檬病原真菌。隨后，通過形態學觀察和分子生物學鑒定等手段，明確引起青檸檬采后腐敗的真菌種類。在此基礎上，進一步利用紫外光結合發光二極管（ LED ）光誘導 CTS-TiO2-Ag 納米復合膜液對分離得到的腐敗真菌進行抑菌實驗，研究其對青檸檬采后腐敗真菌的抑制作用，包括對抑菌圈、霉菌生長、菌絲干質量、胞外電導率、蛋白質和核酸外滲等多個指標的影響，以期為青檸檬的保鮮和防腐提供一種高效、環保的新方法，同時也為光誘導抗菌技術的應用提供理論依據和實踐參考。

1 青檸檬致腐真菌的分離純化、回接驗證及致病性分析

取自然腐敗的青檸檬，采用平板劃線法培養分離純化得到的3 株形態學不同的致病菌，以F1、F2和F3進行編號區分，如圖1所示。將分離純化得到的3 株形態學不同的真菌F1、F2和F3采用有傷接種法分別回接到完好的青檸檬上的不同部位，以形成實驗（a、b、c）和對照部位（d），并將其置于保鮮盒中，放置10 d后對其進行觀察。結果表明，對青檸檬存在較強致病作用的病原菌為F1和F3，相比較而言，F2致病作用較弱。由圖2可知，青檸檬的實驗部位（F1a～F1c、F2a～F2c、F3a～F3c）明顯變黃，變軟，凹陷，且隨時間延長，病斑直徑不斷生長擴大，且有強烈的腐敗氣味、霉味，表面出現菌體生長，直至整個青檸檬腐敗。但是對照部位（F1d、F2d、F3d）的顏色、質地等在相同時間內無明顯變化。另外，在相同時間條件下，回接F1和F3菌株的青檸檬變黃變軟的速度快于回接F2菌株的青檸檬，即F1和F3對青檸檬的致腐性強于F2。將回接后再分離得到菌株與自然腐爛分離得到的菌株形態進行對比，結果一致，根據科赫法則原理，可以確定分離出的菌株能夠使青檸檬腐敗。所以認為F1、F2和F3是導致采后青檸檬腐敗的重要致腐菌。

2 青檸檬病原真菌的形態特征觀察及鏡檢

對分離純化后得到的菌株進行形態學觀察，分離所得3 株主要腐敗菌PDA菌落形態如圖3所示，致腐真菌F1呈圓形，邊緣整齊，質地疏松，外觀干燥，顏色正面暗黃綠色后變橄欖灰，反面為乳黃色，呈絨狀；致腐真菌F2呈圓形，邊緣整齊，質地疏松，外觀干燥，顏色正面菊藍色，反面為橘紅色，呈密氈狀；致腐真菌F3呈圓形，邊緣整齊，質地疏松，外觀干燥，顏色正面淡灰綠色，反面為乳黃色，呈絨狀。

對分離純化后得到的菌株進行鏡檢觀察，分離所得3 株腐敗菌鏡檢結果如圖4所示，致病菌F1菌絲有橫隔，分生孢子梗短，帚狀枝大而不規則，分生孢子卵形至圓柱形；致病菌F2菌絲有橫隔，菌絲細長，分生孢子呈球形；致病菌F3菌絲有橫隔，分生孢子梗集結成束，帚狀分支3 層，分生孢子圓筒形至橢圓形或近球形。結合圖3青檸檬病原真菌的形態特征觀察結果，初步判斷菌株F1、F2和F3均為真菌，且為青霉屬。

3 青檸檬致腐真菌ITS區PCR擴增產物凝膠電泳成像

圖5展示了F1、F2和F3 3 株病原菌的PCR擴增結果，3 條較明顯的序列DNA條帶分別對應F1、F2、F3，且DNA序列大小在500～750 bp之間，這與真菌的ITS序列片段長度一般在500～750 bp吻合，說明3 株致腐菌的ITS序列均被成功擴增，同時可以初步判斷3 株致腐菌均為真菌，這與菌株形態特征觀察結果一致。

4 BLAST序列比對及系統發育樹的構建

利用ContigExpress軟件對獲得的序列進行拼接和測序結果的處理，確保序列的準確性和完整性。在拼接過程中，去除序列首尾兩端可能存在的不準確部分。將拼接好的序列提交至NCBI數據庫進行比對分析，得出與菌株F1、F2和F3序列相似度最高的菌株分別為P. digitatum、P. jacksonii、P. italicum，且相似度均達99%以上。利用MEGA 11.0軟件構建了青檸檬病原菌的系統發育樹，如圖6所示，菌株F1與指狀青霉（P. digitatum）存在較近的親緣關系；菌株F2則與杰克遜青霉（P. jacksonii）關系緊密；而菌株F3則與意大利青霉（P. italicum）有著較近的親緣性。進一步地，在NCBI數據庫中對這3 株菌的基因序列進行了BLAST同源性對比，結果顯示與其近緣菌株的相似度均高達99%以上，其中最高相似度甚至達到了100%。

5 UV結合LED光誘導復合膜液對霉菌抑菌圈的影響

在抑菌圈實驗中，當抑菌環寬度大于1 mm時，可被認為具有良好的抑菌活性。由表1～3可知，處理組相較于對照組都具有一定的抑菌性；隨著光誘導時間的延長，抑菌圈直徑總體呈增大的趨勢。當光誘導時間相同且為90 min時，對F1～F3菌具有最好效果的光處理分別為紫外結合LED燈紅光、紫外結合LED燈綠光和紫外結合LED燈紅光，抑菌圈直徑分別為（8.38±0.12）、（9.62±0.05）mm和（10.49±0.24）mm，分別是對照組的1.63、2.02 倍和2.31 倍；與光誘導30 min處理組相比，分別是其1.31、1.15 倍和1.63 倍。由此可得，對F1和F3菌而言，抑菌效果較優的光處理和光誘導時間均為紫外結合LED燈紅光誘導90 min，抑菌圈直徑分別為（8.38±0.12）、（10.49±0.24）mm；對F2菌而言，抑菌效果較好的光源及光誘導時間為紫外結合LED燈綠光60 min，其抑菌圈直徑為（9.69±0.17）mm。

6 UV結合LED光誘導復合膜液對霉菌菌絲干質量的影響

菌絲干質量是抗霉菌研究中衡量抑菌效果的關鍵指標之一，可以從數值的大小直觀反映霉菌菌絲的生長情況。這一指標不僅反映了霉菌的生長活力，更是評估抑菌效果的重要依據。菌絲作為霉菌的主要生長形態，其干質量的大小直接關聯到霉菌的生命活動和新陳代謝，通過對比不同條件下霉菌的菌絲干質量，可以直觀地了解抑菌劑對霉菌生長的抑制程度。圖7展現了不同光源及光照時間誘導復合膜液對F1～F3霉菌菌絲干質量的影響。總體而言，相同光照時間、不同結合光誘導組菌絲干質量均小于對照組，隨著誘導時間的延長，3 種致腐菌菌絲干質量均不斷減少，且不同誘導光源之間具有顯著性差異（

P

＜ 0.05 ），表明結合光較單一紫外誘導抑菌效果好。當光誘導時間相同且均為 90 min 時，對 F1 ～ F3 菌株產生很好抑制效果的誘導光源為紫外結合 LED 燈紅光、紫外結合 LED 燈紅藍光和紫外結合 LED 燈綠光，菌絲干質量分別為 9.53 、 11.63 、 9.57 mg ，較對照組分別減少了 48.20% 、 42.79% 、 57.46% ，較光誘導 30 min 處理組分別減少了 48.29% 、 42.90% 、 32.74% 。由此可得，紫外結合不同 LED 燈光可以誘導 CTS-TiO2-Ag 復合膜液對青檸檬致腐菌菌絲干質量產生顯著影響，并且在 90 min 處理時間時的影響相對最大；對 F1 ～ F3 菌而言，較優的光處理分別為紫外結合 LED 燈紅光、紫外結合 LED 燈紅藍光和紫外結合 LED 燈綠光，效果較好的光誘導時間均為 90 min 。

7 UV結合LED光誘導復合膜液對霉菌菌絲生長抑制率的影響

菌絲生長抑制率是一個在抗真菌效果評估中至關重要的指標，不僅能夠體現抗真菌藥物或處理方法的抗菌效力，還能從側面反映出菌體細胞被破壞的情況。菌絲生長抑制率的高低直接反映了抗真菌藥物或處理方法的效力，較高的生長抑制率意味著抗菌劑或處理方法對霉菌的生長具有較好的抑制作用，能夠有效地破壞菌體細胞的結構和功能。抑菌效果越好，則霉菌生長受到抑制，即菌絲生長抑制率越大。由圖8可知，與對照組相比，不同光誘導復合膜液對3 種致腐青霉菌均有抑制效果，并受紅光照射影響最大。隨著處理的時間延長，指狀青霉（F1）和杰克遜青霉（F2）菌絲生長抑制率上升趨勢顯著，意大利青霉（F3）菌絲生長抑制率有略微上升。經紫外結合LED燈紅光誘導90 min處理后，F1～F3菌絲生長抑制率分別為90.57%、60.21%、56.06%，均高于經30 min時間處理后的菌絲生長抑制率（67.43%、41.07%、47.25%）。由此可得，當光誘導時間相同時，對3 種青檸檬致腐微生物影響較好的處理光源為紫外結合LED紅光處理組；當誘導光源相同時，F1～F3菌株的菌絲生長抑制率與誘導時間呈正相關；對青檸檬分離純化得到的3 種致病菌較優抑菌處理條件均為紫外結合LED紅光誘導90 min。

8 UV結合LED光誘導復合膜液對霉菌胞外電導率的影響

真菌膜對于維持細胞正常功能起著至關重要的作用，許多研究發現各種抗真菌藥物直接或間接靶向細胞膜或其成分，其目的是破壞膜結構，通過特異性作用于質膜殺死真菌。胞外電導率是衡量抗真菌效果的重要指標，它的值與細胞膜通透性密切相關，胞外電導率越大，則表示菌體細胞膜被破壞得越嚴重。不同光源及光照時間誘導復合膜液對F1～F3 3 種霉菌的細胞膜通透性的影響如圖9所示。3 種青檸檬致病菌在相同時間下結合光誘導組胞外電導率較對照組均有所增加，在90 min處理時間時電導率大于30、60 min處理組。F1～F3菌株依次在紫外＋紅綠藍結合光、紫外＋綠光、紫外＋紅光處理90 min時電導率增加最大，分別為8.49、8.27、8.30 mS/cm，較對照組分別增加了34.55%、31.90%、25.95%，較結合光誘導30 min處理組（6.64、7.88、7.96 mS/cm）分別增加了27.86%、4.95%、4.27%。由此推測，結合光誘導組引起電導率增大可能是由于在光催化條件下，CTS及其復合膜液對細胞膜具有更強的破壞作用，可能導致細胞膜完整性受損，甚至加劇破壞程度，這種破壞作用使得菌體細胞內的物質更容易滲出，進而造成電導率的上升。結果表明，不同結合光誘導對青檸檬致病菌的影響不盡相同，但抑真菌效果隨著誘導時間的延長而增強，且均在誘導時間為90 min時效果較優，表明此時菌體細胞細胞膜受到損傷較為嚴重，胞內物質大量外滲。

9 UV結合LED光誘導復合膜液對霉菌細胞蛋白質外滲的影響

細胞膜不但是真菌必不可少的組成部分，也是大部分抗菌物質作用的靶點，其在微生物生命活動中的作用十分重要，而細胞內容物的泄漏可反映出細胞膜受到嚴重且不可逆的損傷。當菌體細胞膜受到破壞時，原本位于細胞內部的蛋白質可能會泄漏到細胞外部。蛋白質作為生命活動的重要基礎，其分子結構中含有多種氨基酸，如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等，這些氨基酸中的苯環結構在紫外280 nm波長處有最大吸收峰，其吸收值與蛋白質濃度呈正比，且該值與菌體細胞膜被破壞的程度也呈正比。由圖10可以看出，F1～F3菌株不同結合光誘導組在相同光照時間下較對照組OD280值顯著增大（

P

＜ 0.05 ）。綜合來看，當光誘導時間相同且為 90 min 時，對 3 種青檸檬致腐菌株產生很好抑制效果的誘導光源均為紫外＋紅光，其蛋白質溶出值（ 1.16 、 1.63 、 1.53 ）與對照組相比（ 0.83 、 0.87 、 1.03 ），分別增加 39.76% 、 87.36% 、 48.54% ，與 30 min 光誘導處理組（ 0.87 、 1.28 、 1.28 ）相比，分別增加 33.33% 、 27.34% 、 19.53% 。由此可得，紫外結合不同 LED 燈光可以夠誘導 CTS-TiO2-Ag 復合膜液對青檸檬致腐菌細胞膜產生顯著影響；對 F1 ～ F3 菌而言，較好的光處理為紫外結合 LED 燈紅光，效果較好的光誘導時間均為 90 min 。

10 UV結合LED光誘導復合膜液對霉菌細胞核酸外滲的影響

核酸作為生命體中至關重要的遺傳物質，其結構特點之一是含有嘌呤和嘧啶這兩大類堿基。這些堿基是核酸分子中的關鍵組成部分，負責存儲和傳遞遺傳信息。這些堿基的共同特征之一是它們都含有共軛雙鍵（—C＝C—C＝C—），這種特殊的化學結構使得核酸分子在紫外光區展現出獨特的光學性質。具體來說，當核酸分子受到波長在250～280 nm范圍的紫外光照射時，這些共軛雙鍵會強烈吸收光能。其中，最大吸收值通常出現在260 nm左右，其吸收值與核酸濃度呈正比，且該值與菌體細胞膜被破壞的程度也呈正比，常用該值反映菌體細胞核酸類物質外滲情況。從圖11可以看出，在相同光照條件下，3 種致腐菌的OD260值隨時間延長均呈明顯上升趨勢（

P

＜ 0.05 ），在相同時間內，紫外結合紅光照射下 3 種致腐菌的 OD280 值最大，在 90 min 的光照時間下，其核酸外滲值（ 1.14 、 1.46 、 1.45 ）與對照組（ 0.86 、 0.99 、 1.00 ）相比，分別增加 32.56% 、 47.47% 、 45.00% ，與 30 min 處理組（ 0.95 、 0.97 、 1.03 ）相比分別增加 20.00% 、 50.52% 、 40.78% 。結果表明在紫外＋紅光結合光照下 CTS-TiO2-Ag 復合膜液處理可導致檸檬致腐菌核酸類物質外滲，并且隨著時間延長外滲量呈增加趨勢，光照 90 min 時，核酸類物質外滲量較大。

結 論

本研究通過對腐爛青檸檬上的腐敗真菌進行純化分離，最終分離出3 株菌株，將這3 株菌株根據科赫法則在新鮮青檸檬反接種時皆出現明顯的腐壞癥狀，通過回接到新鮮青檸檬上驗證3 種菌株的致病性，從系統發育樹得到的近源菌株與分離菌株的形態學特征基本一致，最終確定菌株F1是指狀青霉（P. digitatum），F2是杰克遜青霉（P. jacksonii），F3是意大利青霉（P. italicum）。

在明確青檸檬致腐真菌后，探究了紫外結合LED燈誘導CTS-TiO2-Ag納米復合膜液對P. digitatum、P. jacksonii和P. italicum的抑菌效果。結果表明，當誘導光源相同時，隨著光誘導時間的延長，其抑菌評價指標呈現向好的趨勢；總體而言，紫外結合LED燈光誘導效果優于純紫外誘導；當光誘導時間相同時，UV結合LED紅光處理效果最佳。CTS作為載體，可增強TiO2和Ag的分散性和穩定性，同時三者具有協同抗菌作用，加上光誘導生成多種具有強氧化性的活性基團，如羥自由基和超氧陰離子自由基，破壞菌體細胞細胞壁膜，使得內容物外滲，體現在胞外電導率、核酸和蛋白質外滲值增加；另外，穿透細胞壁后，作用于菌體內蛋白質，抑制其合成，改變其結構，從而影響菌體的正常生長和能量傳輸過程，菌體被抑制，體現在抑菌圈增加、菌絲干質量下降、菌絲生長抑制率上升。結果表明，此抑菌方式抗真菌過程中涉及了多種組分的協同作用，這種復合材料通過破壞菌體細胞的結構和功能，可有效地抑制和殺滅真菌。

作者簡介

通信作者：

邢亞閣教授

西華大學食品與生物工程學院

博士、教授、碩士生導師，成都市第十八屆人大代表，九三學社成都市委委員、九三學社西華大學主委。第十二批四川省學術和技術帶頭人后備人選，科技部三區服務專家，西華大學首批“青年學者”，首批十名唐立新優秀學者之一，2015.11-2016.11加拿大圭爾夫大學訪問學者。研究方向為農產品貯藏保鮮與精深加工技術。第一作者和通訊作者發表SC1收錄英文文章70余篇，參編英文著作1部，主持編著《食品工業技術經濟學》教材1部，申請國家發明專利60余項。主持參與國家級、省部級、市級和企業委托項目40余項。獲四川省科技進步二等獎1 項、天津市科技進步二等獎2 項，四川省科技進步三等獎2 項，完成省級鑒定成果或評價10余項。

工作經歷

2003.7-2005.2，鄭州三全食品股份有限公司工作;2005.3-2006.7 鄭州鑫泉水處理工程有限公司工作;

2011.7-至今，西華大學食品與生物工程學院工作

2015.11-2016.11，加拿大豐爾夫大學訪問學者

教育經歷

2006.9-2011.6，天津科技大學農產品加工及貯藏工程專業碩博連讀，攻讀碩士、博士學位。

2000.9-2003.7，信陽農林學院(原信陽農專)，食品工藝專業大專。

研究方向

農產品貯藏保鮮技術

農產品非熱精深加工技術

川菜工業化與新型泡菜生產技術

第一作者：

楊路林 研究生在讀

西華大學食品與生物工程學院

本文《 青檸檬腐敗真菌分離鑒定及UV結合LED光誘導復合膜液對其抑菌效果》來源于《食品科學》2025年46卷第17期142 -152 頁，作者：楊路林, 范湘鳳, 邢亞閣 * , 何 麗，但 利，雷春曉，田 園 。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250318-134. http://www.spkx.net.cn 點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。

實習編輯：申婧婧；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網。