J. Future Foods | 采用陰離子交換樹脂-超濾-pHPLC聯(lián)用技術(shù)從炒蘿卜籽中制備蘿卜苷并探究其抗高血脂活性

本文系Journal of Future Foods原創(chuàng)編譯，歡迎分享，轉(zhuǎn)載請(qǐng)授權(quán)

Introduction

高脂血癥是一種常見的慢性心血管疾病，其特征是總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）異常升高，而高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）下降，是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和冠心病等心血管疾病的重要誘因之一。目前臨床治療高脂血癥的藥物雖有效，但多數(shù)存在惡心、腹痛、肝酶升高等副作用。因此，從植物源功能食品中尋找安全有效的降脂藥物成為重要替代策略。

硫代葡萄糖苷（glucosinolates，GLs）是一類含氮和硫的次生代謝物，主要存在于十字花科植物中，其核心結(jié)構(gòu)包含

D

Raphanus sativus

本研究通過靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)篩選最佳樹脂，進(jìn)一步通過動(dòng)態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)優(yōu)化上樣條件（樣品pH、濃度、流速、樹脂直徑高度比、上樣體積）和洗脫條件（洗脫液濃度、流速、體積），利用超濾和pHPLC去除NaCl并純化GRE，通過HPLC測(cè)定純度，采用HPLC-飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC-TOF-MS）和核磁共振（NMR）對(duì)GRE的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。最后，通過觀察高脂血癥小鼠灌胃不同劑量GRE后的體質(zhì)量、血清及肝組織中TG、TC、HDL-C、LDL-C、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、載脂蛋白A（Apo-A）、載脂蛋白B（Apo-B）水平變化及肝組織病理變化，評(píng)估GRE的抗高脂血癥活性。

圖1 GRA（a）和GRE（b）的結(jié)構(gòu)

Results

HPLC方法驗(yàn)證

由GRE標(biāo)準(zhǔn)溶液和 SSR 樣品溶液的色譜圖可知，GRE色譜峰分離良好，無其他化合物干擾（圖2）。結(jié)果表明， 該 HPLC 方法適用于SSR中 GRE 的定量分析。

化合物1，GRE。

圖2 GRE標(biāo)準(zhǔn)溶液（a）和SSr樣品溶液（b）的色譜圖

陰離子交換樹脂篩選

6 種陰離子交換樹脂對(duì)GRE的吸附和解吸能力結(jié)果顯示（圖3），D201-OH?樹脂解吸率最低，無法有效解吸GRE；D315-OH?和D315-Cl?樹脂雖解吸率較高，但吸附率低，不能有效吸附GRE。與D301-OH?樹脂相比，D301-Cl?樹脂的靜態(tài)吸附率和解吸率更高；與D201-Cl?樹脂相比，D301-Cl?樹脂靜態(tài)吸附率略低，但解吸率更高。綜合表明，D301-Cl?陰離子交換樹脂最適合分離GRE。

圖3不同陰離子交換樹脂的靜態(tài)吸收率和解吸率

動(dòng)態(tài)吸附與解吸條件優(yōu)化

上樣條件：樣品pH值對(duì)D301-Cl?樹脂吸附GRE的能力無顯著影響，選擇原溶液pH=6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（圖4a）。樣品濃度為0.10g/mL時(shí)吸附量（AC）適中，且高于0.15g/mL時(shí)AC未顯著增加，故選擇0.10 g/mL（圖4b）。當(dāng)樣品流速大于2 BV/h時(shí)，AC呈下降趨勢(shì)，確定流速為2 BV/h（圖4c）。樹脂柱直徑高度比（1:4～1:12）對(duì)AC影響較小，選擇1:8（圖4d）。突破曲線顯示，當(dāng)上樣體積超過7BV時(shí)，突破率超過10%，因此最佳上樣體積為7 BV（圖5）。

圖4 樣品pH值對(duì)AC的影響（a）、樣品濃度對(duì)AC的影響（b）、吸附流量對(duì)AC的影響（c）、直徑高度比對(duì)交流電的影響（d）

圖5 穿透曲線隨樣品體積的變化

洗脫條件：NaCl為 5 g/100 mL時(shí)洗脫率最高，選為洗脫液（圖6a）。洗脫流速為2 BV/h時(shí)洗脫率最高，確定此流速（圖6b）。當(dāng)洗脫體積超過4 BV時(shí)，洗脫率保持恒定，表明GRE已完全洗脫，最佳洗脫體積為4 BV（圖 6c）。

圖6 NaCl濃度對(duì)GRE洗脫速率的影響（a）、(b)洗脫流速對(duì)GRE洗脫速率的影響（b）、洗脫液體積對(duì)GRE洗脫速率的影響（c）

GRE的純化與純度測(cè)定

超濾后的粗GRE仍含雜質(zhì)，經(jīng)pHPLC純化并凍干后，HPLC面積歸一化法測(cè)得純度為95.1%（圖7、8）。

圖7 GRE的pHPLC純化

圖8 GRE的HPLC面積歸一化法分析

結(jié)構(gòu)鑒定

分子質(zhì)量測(cè)定：HPLC-TOF-MS 在負(fù)離子模式下檢測(cè)到GRE的 [M-H]?離子峰為m/z 434.025 9，與計(jì)算分子質(zhì)量（m/z 434.024 9）一致（圖9）。

圖9 GRE的分子質(zhì)量

核磁共振分析：1H和 13C NMR譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的GRE NMR數(shù)據(jù)一致，進(jìn)一步確認(rèn)其結(jié)構(gòu)（圖10）。

圖10GRE的1H-NMR譜（a）和13C-NMR譜（b）

抗高脂血癥活性評(píng)估

體質(zhì)量變化：模型組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)顯著高于對(duì)照組，中、高劑量GRE組（mGRE、hGRE）和辛伐他汀（SV）組體質(zhì)量增長(zhǎng)顯著低于模型組結(jié)果表明中、高劑量GRE可抑制高脂飲食小鼠體質(zhì)量增加（圖11）。

與對(duì)照組相比，*

P

P

圖11 給藥期間小鼠體質(zhì)量（a）和體質(zhì)量變化（b）

臟器系數(shù)與形態(tài)：模型組肝系數(shù)顯著高于對(duì)照組，mGRE、hGRE和SV組肝系數(shù)顯著低于模型組，腎臟系數(shù)各組無顯著差異。模型組肝臟表面粗糙，mGRE和hGRE組肝臟形態(tài)接近對(duì)照組，腎臟形態(tài)無明顯差異（圖12、13）。

圖12肝臟（a）和腎臟（b）系數(shù)

圖13 小鼠肝臟（a）和腎臟（b）形態(tài)

血脂參數(shù)：模型組血清TC、TG、LDL-C、Apo-B水平顯著升高，HDL-C、Apo-A水平顯著降低；mGRE和SV組顯著逆轉(zhuǎn)上述變化，肝組織TC、TG水平變化與血清一致（圖14）。

圖14小鼠血清中 TC（a）、 TG（b）、HDL-C（c）、LDL-C（d）、Apo-A（e）、Apo - B（f）水平和小鼠肝臟 TC（g）和 TG（h）水平

肝功能指標(biāo)：模型組血清ALT、AST水平顯著高于對(duì)照組，GRE各劑量組和SV組均能不同程度降低ALT、AST水平，表明GRE對(duì)肝損傷有保護(hù)作用（圖15）。

圖15 小鼠血清中ALT（a）和AST（b）水平

肝組織病理：H&E染色顯示，模型組肝細(xì)胞脂肪空泡大量堆積、排列紊亂，mGRE和hGRE組脂肪空泡顯著減少；油紅O染色結(jié)果一致，模型組脂質(zhì)沉積明顯，mGRE和hGRE組脂質(zhì)滴顯著減少（圖16、17）。

圖166 組肝臟組織H&E切片代表性圖像

圖17 6 組肝臟組織油紅O切片代表性圖像

Conclusion

本研究建立了一種穩(wěn)定、低成本的陰離子交換樹脂-超濾-pHPLC聯(lián)用技術(shù)從炒蘿卜籽中制備GRE。通過靜態(tài)和動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，確定最佳樹脂為D301-Cl?，最佳上樣條件為：原溶液pH＝6、濃度0.10 g/mL、流速2 BV/h、上樣體積7 BV、樹脂直徑與高度比1:8；最佳洗脫條件為：5 g/100 mL NaCl溶液、流速2 BV/h、洗脫體積4 BV。經(jīng)超濾和pHPLC純化后，GRE純度達(dá)95.1%。

抗高脂血癥實(shí)驗(yàn)表明，GRE對(duì)高脂血癥小鼠具有明顯的調(diào)脂作用，可降低體質(zhì)量、改善血清和肝組織脂質(zhì)水平、減輕肝脂質(zhì)沉積并保護(hù)肝臟。本研究為GRE的制備提供了可靠方法，提高了蘿卜籽利用率，同時(shí)證實(shí)了GRE的抗高脂血癥活性，提示其有望開發(fā)為潛在的抗高脂血癥藥物或膳食補(bǔ)充劑，對(duì)高脂血癥的日常預(yù)防具有重要意義。

Preparation of glucoraphenin by an integrated approach of anion exchange resin-ultrafiltration-pHPLC from stir-fried seeds of

Raphanus sativus

Zhuang Miaoa1, Shaohua Yua1, Yuanyuan Zhanga, Xinyue Yua, Huagang Shengab*, Honglei Zhouab*, Liqiao Zhuab*

a

College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China.

b

Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Classical Theory, Ministry of Education, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China

1

These authors contributed equally to this work.

*Corresponding authors.

Abstract

The objective of this study was to establish an efficient and low-cost method for preparing glucoraphenin (GRE) from stir-fried seeds of Raphanus sativus L., and then evaluate the anti-hyperlipidemia activity of GRE. The optimal resin was selected by comparing adsorption and desorption ability of six kinds of anion exchange resins for GRE. The loading and elution conditions of the optimal resin for GRE were then optimized by dynamic adsorption and desorption experiments. The results showed that D301-Cl? resin was the optimal resin, and the optimal loading conditions were the original sample solution (pH?=?6) with a concentration of 0.10 g/mL, the sample loading flow rate was 2 BV/h, and the sample volume was 7 BV. The optimum elution conditions were as follows: the elution solution was 5 g/100 mL NaCl, followed by subsequent elution with 4 BV at an elution flow rate of 2 BV/h. The collected eluent was further purified by ultrafiltration and preparative high-performance liquid chromatography (pHPLC) to obtain GRE, and the molecular weight and structure of GRE were determined by high performance liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry and nuclear magnetic resonance, respectively. The purity of GRE was detected to be 95.1% by HPLC. Animal experiments showed that GRE had anti-hyperlipidemic effects by improving serum and liver lipid levels, alleviating liver lipid deposition, and protecting the liver. This study indicated that GRE may be a potential anti-hyperlipidemia drug candidate or dietary supplement.

Reference:

MIAO Z, YU S H, ZHANG Y Y , et al. Preparation of glucoraphenin by an integrated approach of anion exchange resin-ultrafiltration-pHPLC from stir-fried seeds of

Raphanus sativu

翻譯：張慶芬（實(shí)習(xí)）

編輯：龔藝；責(zé)任編輯：梁安琪

封面圖片來源：攝圖網(wǎng)

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