《食品科學》：中國農(nóng)業(yè)大學李全宏教授等：南瓜籽抗氧化肽的制備表征及其對H2O2損傷Caco-2細胞的保護作用

南瓜是傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)中的重要蔬菜之一，南瓜籽具有藥食兩用功效，含有蛋白質(zhì)、脂肪酸、多糖、維生素、單寧、類胡蘿卜素、角鯊烯、植物甾醇等物質(zhì)，其含有的功能性成分在預防人類疾病和促進人類健康方面都起到關(guān)鍵作用。許多研究表明，南瓜籽提取物具有驅(qū)蟲、抗癌、抗糖尿病和降血糖、抗菌等作用。南瓜籽蛋白是南瓜籽加工后的產(chǎn)物。

近年來，從南瓜籽蛋白制備肽的相關(guān)研究中，較多集中于抗氧化肽。本研究以脫脂南瓜籽粉為原料，采用亞臨界水解法制備南瓜籽多肽，對制備的多肽進行抗氧化活性分析、結(jié)構(gòu)表征，并進一步通過超濾和反相高效液相色譜（RP-HPLC）法純化得到南瓜籽抗氧化肽。利用H2O2誘導的Caco-2細胞氧化損傷模型，評估南瓜籽抗氧化肽對細胞氧化損傷的保護作用。

中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院的韓蕈澤、于文珺、李全宏*等研究旨在為南瓜籽的深度開發(fā)和高值化利用提供理論支持，同時為開發(fā)具有抗氧化功能的南瓜籽多肽產(chǎn)品奠定基礎。

1南瓜籽多肽純度及體外抗氧化活性評價

南瓜籽多肽的純度和得率分別為70.12%和88.54%（數(shù)據(jù)未展示）。ABTS陽離子自由基及DPPH自由基清除能力被廣泛應用于評估肽的抗氧化活性。體系內(nèi)的抗氧化劑會抑制綠色的ABTS陽離子自由基生成，因此于734 nm波長處測量吸光度可以判斷其自由基清除能力。DPPH自由基溶解于無水乙醇呈深紫色，抗氧化劑使其顏色變淺，在517 nm波長處吸光度減弱，以此可判斷抗氧化劑的自由基清除能力。南瓜籽多肽的抗氧化活性如圖1所示，從DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率及FRAP 3 個方面探究，可以看出在1～40 mg/mL質(zhì)量濃度范圍之間，隨著南瓜籽多肽質(zhì)量濃度增加，3 種體外抗氧化指標均提升，呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。

如圖1A所示，當南瓜籽多肽的質(zhì)量濃度從1 mg/mL增加到40 mg/mL時，DPPH自由基清除率從（28.80±0.09）%升高至（91.62±0.48）%。當南瓜籽多肽質(zhì)量濃度從1 mg/mL增加到40 mg/mL時，其ABTS陽離子自由基清除率由（16.95±0.28）%升高至（83.55±0.37）%。金屬離子還原能力也可以作為抗氧化能力的評價指標，如圖1B所示，隨濃度增加南瓜籽多肽的FRAP從（0.14±0.01）μmol/mL升至（0.83±0.08）μmol/mL。Barea等利用亞臨界水處理可溶性魚粉蛋白，以FRAP方法評估抗氧化能力，結(jié)果顯示亞臨界水處理的水解產(chǎn)物有較強的抗氧化能力。上述結(jié)果表明，通過亞臨界水解法制備的南瓜籽多肽具有良好的抗氧化活性。

2 南瓜籽多肽分子質(zhì)量分布

亞臨界水解法制備的南瓜籽多肽的分子質(zhì)量分布如圖2所示，分布結(jié)果如表1所示，亞臨界水解法處理后的水解物中＜500 Da的組分占28.09%，＜1 000 Da的組分占41.83%，說明亞臨界水解法可以有效降解蛋白質(zhì)分子，獲得較多的小分子質(zhì)量肽。肽的分子質(zhì)量分布對其抗氧化能力有影響，較大分子質(zhì)量的肽可能會產(chǎn)生空間位阻，因而自由基清除能力較低，與較大分子質(zhì)量肽相比，低分子質(zhì)量肽常表現(xiàn)出更強的抗氧化能力。Zhang Jixian等從小麥胚芽蛋白水解物中分離出不同分子質(zhì)量肽組分，其中＜1 000 Da的肽組分與其他組分相比，具有更高的抗氧化活性。因此，亞臨界水解法制備南瓜籽多肽的抗氧化能力與其含有較多低分子質(zhì)量的肽有關(guān)。

3 南瓜籽多肽氨基酸組成分析

如表2所示，疏水性氨基酸相對含量為38.69%，疏水性氨基酸常出現(xiàn)在抗氧化肽序列中，通過提高脂溶性自由基和多不飽和脂肪酸的可及性，抑制氧化損傷。此外，組氨酸相對含量為2.81%，芳香族氨基酸相對含量為12.47%，芳香族氨基酸通過提供電子將自由基轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定分子，同時通過共振結(jié)構(gòu)保持自身的穩(wěn)定性從而發(fā)揮抗氧化作用。谷氨酸和天冬氨酸的相對含量較高，分別為15.08%和10.80%，這兩種氨基酸可以通過清除自由基或螯合金屬離子的方式抵抗氧化。Nourmohammadi等用堿性蛋白酶水解南瓜籽粕蛋白質(zhì)得到的多肽中疏水性氨基酸相對含量為33.49%，也表現(xiàn)出抗氧化能力。由此推斷，南瓜籽多肽的抗氧化能力與其氨基酸組成有關(guān)。

4南瓜籽蛋白與南瓜籽多肽FTIR分析

FTIR是一種基于不同官能團有特異性譜帶吸收峰進而分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象特征的技術(shù)，蛋白質(zhì)主要的紅外吸收光譜是由不同的酰胺帶吸收區(qū)組成，F(xiàn)TIR已被廣泛用于表征蛋白質(zhì)分子二級結(jié)構(gòu)。

由圖3可以看出，南瓜籽蛋白、南瓜籽多肽在583.04、594.90 cm-1左右有C＝O面外彎曲振動造成的酰胺VI帶，在1 647.96、1 657.93 cm-1左右有C＝O伸縮振動造成的酰胺I帶，在2 960.65、2 961.85 cm-1左右有飽和C—H伸縮振動，南瓜籽蛋白在1 532.77 cm-1附近的峰為蛋白酰胺II帶中N—H的彎曲振動峰，而南瓜籽多肽在此處的吸收峰消失，說明酰胺II帶含量減少。南瓜籽多肽及南瓜籽蛋白在3 368.54、3 400.10 cm-1具有O—H伸縮振動、N—H伸縮振動帶，并且隨著亞臨界水解，該峰位相較于南瓜籽蛋白而言，向低波數(shù)移動且吸收峰更寬更強，表明肽分子中有更多的氫鍵，可能是因為水解導致分子中的親水基團暴露，氫鍵增加。由此可見，南瓜籽蛋白質(zhì)經(jīng)過亞臨界水解后，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生相應變化。

5 南瓜籽蛋白與南瓜籽多肽紫外光譜分析

蛋白質(zhì)在特定的紫外波長范圍有吸收光譜，對南瓜籽多肽、南瓜籽蛋白進行全波長紫外掃描，如圖4所示，兩種物質(zhì)在280 nm波長左右都有吸收峰，根據(jù)研究可知，在260～280 nm波長處的吸收峰為芳香族氨基酸的吸收峰。南瓜籽多肽吸光度的增加可能是由于埋藏的疏水基團暴露或二級結(jié)構(gòu)修飾導致的增色效應。其中，南瓜籽蛋白質(zhì)的吸收峰在286 nm波長處，而南瓜籽多肽的吸收峰藍移至281 nm波長處，表明亞臨界水解對于南瓜籽蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響。

6 南瓜籽蛋白與南瓜籽多肽紫外光譜分析

6.1

超濾組分抗氧化能力

使用超濾裝置，將南瓜籽多肽分離為組分A（＞10 kDa）、組分B（5～10 kDa）和組分C（＜5 kDa）3 個部分，并測定其抗氧化活性，3 種組分的DPPH自由基清除率及ABTS陽離子自由基清除率結(jié)果如圖5所示。5 mg/mL樣品組分A、B、C的DPPH自由基清除率分別為（57.47±0.78）%、（64.55±0.46）%、（76.14±0.55）%，ABTS陽離子自由基清除率分別為（42.87±0.32）%、（49.65±0.78）%、（57.01±0.42）%。其中，組分C的DPPH自由基清除能力和ABTS陽離子自由基清除能力顯著高于另外兩組及南瓜籽多肽組，故選擇組分C進行RP-HPLC分離收集。Zhang Fang等利用超濾膜分離牡丹種子蛋白水解物，發(fā)現(xiàn)＜5 kDa的組分表現(xiàn)出最強的抗氧化活性。Xia Ji’an等發(fā)現(xiàn)超濾分離后的綠豆蛋白水解物體外抗氧化活性顯著提高。許多研究表明，肽的分子質(zhì)量會對多肽的抗氧化能力產(chǎn)生影響，較小分子質(zhì)量的肽更容易與自由基反應。Liu Qianxia等在對綿羊皺胃蛋白多肽的研究中發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量最小（＜3 kDa）的組分表現(xiàn)出最高的自由基清除率。

6.2

南瓜籽多肽RP-HPLC分離

RP-HPLC法的應用原理是依據(jù)肽分子疏水性的不同，對肽組分進行分離，肽組分中疏水性較弱的部分先洗脫出，疏水性較強的組分后洗脫出，從而實現(xiàn)有效分離。超濾所得組分C的洗脫曲線如圖6所示，依據(jù)洗脫時間不同進行分離并收集到兩部分，按照洗脫時間標記為C1和C2。對分離組分C1、C2抗氧化能力進行比較，結(jié)果如圖7所示，在5 mg/mL條件下，組分C1、C2的DPPH自由基清除率和ABTS陽離子自由基清除率分別為（48.53±0.57）%、（43.11±0.46）%和（81.27±0.13）%、（62.41±0.87）%，C2組均顯著高于C1組，且高于相同質(zhì)量濃度南瓜籽多肽的自由基清除率（圖1A），故選用C2組分進行后續(xù)實驗。

7 南瓜籽蛋白與南瓜籽多肽紫外光譜分析

7.1

南瓜籽抗氧化肽對Caco-2細胞的毒性作用

采用CCK-8法檢測超濾所得組分C及RP-HPLC分離所得組分C2對Caco-2細胞的毒性作用。50、200、400、600、800、1 000 μg/mL質(zhì)量濃度條件下C、C2組分作用于Caco-2細胞24 h，對細胞生長產(chǎn)生的影響如圖8所示。與對照組相比，組分C、C2在50～400 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對Caco-2細胞無明顯毒性效應。故選用50、200、400 μg/mL質(zhì)量濃度樣品開展后續(xù)實驗。

7.2

H2O2誘導Caco-2細胞損傷模型的建立

通過使用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L H2O2與Caco-2細胞共同孵育2、4、6 h，構(gòu)建H2O2誘導的Caco-2細胞氧化損傷模型。如圖9所示，在相同處理時間下細胞存活率隨H2O2濃度增加而降低。1.0 mmol/L H2O2預處理4 h和6 h時，其細胞存活率分別降為50.29%和47.88%，在該條件下，既能誘發(fā)Caco-2細胞氧化應激，又能保持細胞相對活力。相比之下，預處理4 h時間更短且更接近半數(shù)致死濃度，因此后續(xù)實驗中使用的氧化損傷模型誘導條件為1.0 mmol/L H2O2誘導4 h。

7.3

南瓜籽抗氧化肽對氧化損傷Caco-2細胞的保護作用

如圖10所示，其中模型組經(jīng)處理后，細胞存活率顯著下降至50.68%，接近半數(shù)抑制濃度。經(jīng)過質(zhì)量濃度為50、200、400 μg/mL的兩種組分預處理后，細胞存活率與模型組相比均顯著升高，說明兩種組分對于H2O2誘導的氧化損傷Caco-2細胞均有保護作用。相同質(zhì)量濃度下，組分C2處理的細胞存活率均顯著高于組分C。隨著組分C、C2質(zhì)量濃度的增加，對氧化損傷Caco-2細胞的保護作用逐漸增強。

7.4

南瓜籽抗氧化肽處理對Caco-2細胞內(nèi)ROS含量的影響

小分子熒光探針常用于評估細胞內(nèi)ROS含量，以DCFH-DA形式添加，進入細胞后的DCFH無熒光，被ROS氧化后變?yōu)橛袩晒獾亩葻晒馑亍2O2誘導Caco-2細胞會引發(fā)細胞產(chǎn)生過量ROS，如圖11所示，經(jīng)H2O2誘導后的損傷組ROS含量顯著升高，為對照組的1.49 倍，添加200 μg/mL的C、C2組分均可以顯著降低ROS含量，當添加組分C、C2質(zhì)量濃度為400 μg/mL時，ROS含量分別為對照組的1.26 倍和1.11 倍，較損傷模型組下降15.44%和25.50%，與氧化損傷模型組差異顯著，并且同質(zhì)量濃度C2組分ROS含量顯著低于C組分。因此，組分C、C2對氧化應激細胞的保護可以從其ROS清除能力角度解釋，且C2組分表現(xiàn)優(yōu)于C組分。Li Chen等從鱸魚中提取抗氧化肽作用于氧化損傷Caco-2細胞后，細胞中的ROS水平也呈現(xiàn)相同趨勢。Yao Hongliang等氨基酸組成分析表明，抗氧化性差異主要來源于抗氧化氨基酸組成差異，精氨酸含量較高的產(chǎn)物具有較高抗氧化活性。

7.5

南瓜籽抗氧化肽處理對Caco-2細胞內(nèi)DNA含量的影響

ROS攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸會引起脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生MDA，MDA含量常反映細胞脂質(zhì)氧化損傷程度，MDA含量越高，細胞氧化損傷程度越重。如圖12所示，經(jīng)過H2O2處理后的模型損傷組細胞內(nèi)MDA含量與對照組相比顯著升高，使用不同質(zhì)量濃度組分C、C2對細胞進行預處理后，MDA含量均有所下降且與添加濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。這與Mohammad等使用H2O2誘導大鼠心臟組織的氧化損傷，經(jīng)南瓜籽提取物處理組的MDA含量較損傷模型組顯著降低，并且呈現(xiàn)劑量依賴的結(jié)果一致。相同質(zhì)量濃度C2組分處理后的MDA含量均低于C組分，當兩種組分質(zhì)量濃度為400 μg/mL時，細胞內(nèi)的MDA含量顯著下降，因此C、C2兩種組分對于細胞的脂質(zhì)過氧化均有顯著改善作用。

7.6

南瓜籽抗氧化肽處理對Caco-2細胞內(nèi)SOD、CAT含量的影響

SOD和CAT是重要的抗氧化酶。SOD作為細胞抵抗自由基第1道防線的重要組成部分，可以防止細胞氧化損傷，CAT可以催化分解細胞代謝產(chǎn)生的H2O2。SOD和CAT等酶驅(qū)動的氧化防御體系可以消除自由基以保持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)。如圖13所示，使用H2O2處理的氧化損傷Caco-2細胞SOD和CAT活性明顯下降，分別為17.47、1.77 U/mL，顯著低于對照組的20.67、6.58 U/mL。與損傷模型組相比，不同濃度C、C2組分處理組SOD和CAT活性均顯著提升，經(jīng)400 μg/mL C、C2組分處理后，其SOD活性分別為19.53、20.05 U/mL，均顯著高于損傷模型組；CAT活性分別為4.38、5.04 U/mL，均顯著高于模型損傷組。實驗結(jié)果表明，C、C2組分可以提高Caco-2細胞抗氧化酶活性，減輕細胞的氧化損傷。

結(jié)論

本研究通過亞臨界水解法從脫脂南瓜籽粉中制備出南瓜籽多肽，并分析了其抗氧化活性。研究發(fā)現(xiàn)，所制備的多肽具有顯著的體外抗氧化能力，能有效清除DPPH自由基和ABTS陽離子自由基，并具有FRAP。通過超濾和RP-HPLC法進一步純化分別得到抗氧化肽C、C2組分，在H2O2誘導的Caco-2細胞氧化損傷模型中顯示出良好的保護作用，顯著提高細胞存活率，降低ROS和MDA含量，增強SOD和CAT活性。綜上，南瓜籽抗氧化肽具有潛在的細胞保護功能，可為南瓜籽的深度開發(fā)和高值化利用提供理論依據(jù)，并為南瓜籽抗氧化肽作為新型抗氧化劑應用于抗氧化功能食品或保健品奠定基礎。

作者簡介

通信作者：

李全宏，教授，博士生導師，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部谷物加工企業(yè)重點實驗室主任、世界中餐業(yè)聯(lián)合會中餐工業(yè)化產(chǎn)業(yè)分會聯(lián)席主席、中國園藝學會南瓜專業(yè)委員會副會長、中國質(zhì)量認證中心（CQC）認證技術(shù)委員會檢測技術(shù)分委會委員、聯(lián)合國工業(yè)發(fā)展組織（UNIDO）中國投資與技術(shù)促進處綠色產(chǎn)業(yè)專家。先后主持國家級科研項目11 項、省部級科研項目15 項、橫向課題16 項，培養(yǎng)碩博士研究生77 人，發(fā)表論文160 余篇，獲授權(quán)專利17 項，制修訂國家標準、團體標準等近10 項，獲省部級科研獎勵9 項、行業(yè)科研獎勵2 項。

本文《南瓜籽抗氧化肽的制備表征及其對H2O2損傷Caco-2細胞的保護作用》來源于《食品科學》2025年46卷第18期146-154頁，作者：韓蕈澤，于文珺，張 雨，趙 婧，李全宏*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250224-117。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實習編輯：北京化工大學王小云；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)