《食品科學》：西南民族大學朱成林副教授等：牛肉酸肉發酵過程中特征風味物質與微生物群落組成的相關性

酸肉是以新鮮畜禽肉為原料，通過自然發酵而成的特色風味發酵肉制品，其主要產地為四川、貴州、湖南、云南等西南地區，因其風味獨特、游離氨基酸和活性肽豐富且具有較長保質期等特點，深受人們喜愛。

發酵肉制品的風味與發酵過程中微生物群落的演替密切相關。發酵微生物主要來自原料及環境中的微生物。目前大多數對酸肉的研究主要集中在微生物菌群組成解析和風味分析等方面。并且目前研究結果表明，發酵能夠有效促進有益微生物的生長繁殖，對提高產品品質具有重要作用，但酸肉發酵過程中微生物群落演替和特征風味物質產生機制的相關研究還比較有限，仍需進一步深入探究。在酸肉發酵中，當前大多數研究是以豬肉為原料發酵酸肉。然而，作為消費量僅次于豬肉和雞肉的第三大肉類，牛肉發酵制品通常具有更濃郁的肉香和醇厚的口感。

基于此，西南民族大學藥學與食品學院的唐鈺婷、周秉德、朱成林*等以牛肉為原料發酵酸肉，采用電子鼻、電子舌以及氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS）技術測定牛肉酸肉發酵過程中的揮發性風味物質，并利用高通量測序技術測定牛肉酸肉發酵過程微生物菌群變化，進而探討其與風味物質的相關性，旨在為牛肉酸肉微生物群落結構及揮發性物質差異提供理論依據和數據支持，為發酵酸肉產品品質提升和大規模工業化生產提供參考。

1 電子鼻分析結果

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種多元統計分析方法，具有能夠確定復雜、難以找到的變量的優點，可以用來評價不同樣品間的差異性。通過對PCA得分和載荷值找到相關的物質，各樣品的揮發性有機物數據是在相似信息的基礎上進行收集和分類。由圖2可知，PC1貢獻率達到79.9%，可以很好地反映樣品的整體信息。將不同傳感器對應的參考化合物進行化合物風味特征比較。由圖2a可知，在PC1維度上，不同發酵時間的酸肉呈現依次分布，酸肉的風味在持續變化。具體來看，T0組與T15、T30和T45組發酵酸肉之間距離較遠，說明通過發酵改變了牛肉的風味。隨著發酵時間的延長，LY2/LG、T40/1、T40/2、TA/2傳感器的響應值增加，而T30/1、PA/2、LY2/Gh、LY2/G、P10/1、LY2/AA、T70/2傳感器的響應值降低，見圖2b。電子鼻可以有效區分不同發酵階段的酸肉樣品。

2 電子舌分析結果

由圖3可知，PC1貢獻率高達98.6%，所占權重大；所用傳感器包括酸味（AHS）、鮮味（NMS）、咸味（CTS）、甜味（ANS）、苦味（SCS）和兩個參比電極（PKS和CPS）。根據電子舌PCA圖（圖3a）可知，牛肉酸肉在不同發酵階段滋味有明顯的區分。由圖3b可知，隨著發酵時間的延長，NMS、ANS、AHS傳感器的響應值增加，而CPS、PKS、SCS、CTS傳感器的響應值降低。T45組與T0、T15和T30組發酵酸肉之間距離較遠，說明T45組酸肉的滋味與其他組的滋味特征有很大差異。這可能是因為在發酵后期pH值下降，酸肉中滋味物質組成發生變化。

3 GC-IMS分析

圖4a為GC-IMS生成的三維譜圖，每一個揮發性化合物代表一個點，顏色深淺代表信號強度，從中可以直觀地看出不同時期牛肉酸肉發酵過程中揮發性物質峰強度有一定的變化。由于在三維譜圖所表現出的各時期的樣品的揮發性物質肉眼難以直接進行差異比較，因此本研究進行了降維處理，生成了圖4b二維平面差異譜圖。選擇T0組作為參考，扣除其他譜圖中的信號峰。整個譜圖背景為藍色，濃度相同的揮發性物質被抵消為白色，藍色表示該物質濃度低于參考樣品，紅色表示該物質濃度高于參考樣品，不同顏色的點出現在不同的位置，直觀地反映了它們之間揮發性物質的差異，顏色越深表示差異越大。根據紅色和藍色出現的位置和深淺可以看出，4 組樣品揮發性風味成分有較大差異。由圖4b可知，4 組樣品間差異點大多數保留在300～1 200 s之間，相對遷移時間在0.5～1.0 ms之間。

不同時期牛肉酸肉發酵過程中揮發性物質指紋圖譜如圖4c所示。每行代表一個樣品，每列代表一個化合物在不同樣品中的含量，化合物含量的高低由顏色的深淺表示。在牛肉酸肉發酵過程中，通過GC-IMS共鑒定出40 種揮發性化合物（包括單體和二聚體），其中醇類13 種、醛類3 種、酸類1 種、酯類12 種、酮類3 種、其他類8 種，具體結果見表2。為了突出顯示揮發性風味物質的總體趨勢，建立了PCA，如圖5所示。

如圖5a所示，PCA中PC1貢獻率為78.2%，極好地概括了4 組牛肉酸肉之間的差異。載荷圖顯示了相對含量與PC1維度上重要性之間的相關性，灰色條表示相關性顯著（P＜0.05）。其中風味化合物中M表示單體，D表示二聚體。由圖5b可知，隨著發酵時間延長，酸肉的特征揮發化合物正丁醛、丁酸甲酯、2,6-二甲基吡嗪M、乙酸乙酯D、β-蒎烯M、乙酸甲酯、2-丁醇、2-甲基丁酸乙酯M、醋酸、2-庚醇、2,6-二甲基吡嗪D、3-甲基丁酸乙酯M響應值顯著（P＜0.05）。酯類化合物主要由短鏈酸和醇在乙酰轉移酶或酯酶存在下的相互作用產生，被認為是發酵肉制品風味的關鍵貢獻者。PCA結果顯示，與T0組相比，T45組的丁酸甲酯、乙酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯M等酯類物質的響應值顯著，為酸肉貢獻更多的蘋果香、甜香。同時乙酸乙酯具有強烈的果味和低閾值，有助于掩蓋不愉快的味道。2-丁醇是一種增味物質，該物質可以通過氨基酸代謝的丙酮酸衍生而來，具有獨特的甜香，賦予酸肉特殊香味。

如圖6所示，T40/1和TA/2與正丁醛、2-甲基丁酸乙酯M、2-丁醇、3-甲基丁酸乙酯M、乙酸甲酯、丁酸甲酯、2,6-二甲基吡嗪M、醋酸、乙酸乙酯D、2,6-二甲基吡嗪D和2-庚醇呈正相關，與異丁醇M、正丁醇M、正己醇M呈負相關。T40/2與β-蒎烯M、2-甲基丁酸乙酯M、2-丁醇、3-甲基丁酸乙酯M、乙酸甲酯、丁酸甲酯、2,6-二甲基吡嗪M、醋酸、乙酸乙酯D、2,6-二甲基吡嗪D和2-庚醇呈正相關，與異戊醇M、異丁醇M、正丁醇M、正己醇M呈負相關。正丁醛、丁酸甲酯、2,6-二甲基吡嗪M等化合物在T45組酸肉中傳感器響應值較高。結果表明電子鼻傳感器響應值和GC-IMS揮發性化合物定量表征可以區分不同發酵時間段酸肉的獨特風味。

4 牛肉酸肉發酵過程中微生物菌群組成分析

4.1

基于ASV豐度表計算細菌α多樣性（ACE、Chao、Shannon和Simpson指數）。ACE指數、Chao指數和Sobs指數用于評價樣品中微生物菌群豐富度。Simpson指數和Shannon指數用于表征微生物菌群多樣性，Shannon指數越大，表示微生物菌群多樣性越高，Simpson指數則與之相反。為了反映不同分組間差異程度，使用單因素方差分析，對α多樣性指數進行顯著性檢驗，結果以箱線圖表示。為直觀展示不同發酵時間段酸肉的微生物多樣性的變化，分別對T0、T15、T30、T45酸肉進行α多樣性指數分析，結果如圖7所示。細菌群落的Coverage大于0.99，表明在酸肉樣品中能夠觀察到大多數的微生物。T0中的ACE、Sobs、Chao指數和Shannon指數與T15、T30、T45組具有顯著差異，發酵T0的酸肉中的ACE、Chao、Sobs指數和Shannon指數均遠高于其他組，表明隨著發酵時間延長，微生物菌群豐富度呈現降低趨勢，并且T0組酸肉中Simpson指數低于發酵后的酸肉，表明發酵后的酸肉中微生物菌群多樣性降低。

4.2

通過β多樣性分析牛肉酸肉發酵過程中微生物菌群組成的差異性，其中NMDS分析是β多樣性分析的一種方法，NMDS分析結果的優劣由Stress值檢驗，Stress在0.5～0.15之間表明NMDS二維圖中的樣本點具有代表性，圖中用不同形狀及顏色的點表示不同的樣本，樣本點之間的距離越遠表明樣本的物種組分差異越大。由圖8可知，T0與T15、T30、T45的牛肉酸肉樣品間的距離均較遠，菌群結構差異較大。結合α多樣性分析可知，此種差異可能來自發酵后微生物菌群豐富度的改變。

4.3 菌群組成分析

根據圖9a所示，牛肉酸肉在發酵過程中微生物門水平細菌群落組成分析，共鑒出10 個相對豐度＞1%的門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、藍菌門（Cyanobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota）、unclassified_k__norank_d__Bacteria、帕特西菌門（Patescibacteria）、蛭弧菌門（Bdellovibrionota）、梭桿菌門（Fusobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）。其中T0組酸肉樣品中的優勢菌門為藍菌門、厚壁菌門，其次是變形菌門。有研究表明未發酵的牛肉中的核心菌群有厚壁菌門、藍菌門、變形菌門、擬桿菌門，與本研究結果一致。隨著牛肉發酵時間延長，厚壁菌門相對豐度升高，在T45時達到91.45%，成為發酵牛肉酸肉中主要優勢菌門。這可能是因為發酵過程中酸度的變化，而厚壁門菌對環境變化具有較高的適應性，同時牛肉本身也含有豐富的厚壁門菌，相比于其他菌門，該類菌門的微生物能夠更好地適應由發酵引起的底物和環境的變化，有利于成為優勢菌門。在牛肉酸肉發酵過程中，菌落多樣性明顯減少，發酵的微生物生態結構也由最初的多種菌門共存演變到以厚壁門菌為主導的單一發酵模式，這與Chen Xi等的研究結果一致。

如圖9b所示，牛肉酸肉在發酵過程中微生物屬水平細菌群落組成分析，共鑒出10 個相對豐度＞1%的屬，分別是乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、norank_f__norank_o__Chloroplast、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、產堿桿菌屬（Alcaligenes）、unclassified_p__Proteobacteria、norank_f__Mitochondria、假單胞菌屬（Pseudomonas）、巨大球菌屬（Macrococcus）。與T0組酸肉菌群組成相比，T15、T30、T45的樣品中乳酸桿菌、魏斯氏菌屬相對豐度顯著升高，成為牛肉發酵過程中的優勢菌屬；而葡萄球菌屬、產堿桿菌屬、假單胞菌屬、巨大球菌屬在發酵過程中相對豐度降低。趙改名等對牛肉發酵香腸成熟過程中理化性質和微生物菌群變化進行研究，結果表明在牛肉發酵香腸中乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬在發酵后期同樣成為優勢菌屬。

4.4 微生物群落組間差異分析

為了進一步確定在牛肉酸肉發酵過程中對細菌群落差異貢獻最大的微生物特征，進行了線性判別分析效應量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe），在LEfSe圖中，y軸表示不同的微生物群落特征，x軸表示LDA分數。每個特征用不同的顏色表示，并按照其富集程度和分類屬于不同的分支體現出來。統計分析從門到屬的水平進行，在LEfSe圖中，可以通過條形圖來確定不同組之間的相對豐度，顏色代表其富集程度。如圖10所示，發現17 個具有顯著差異性的物種，在屬水平上有10 個顯著差異性的物種。乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬在發酵后期階段（T45）富集。

4.5 菌群組成和特征風味物質的相關性分析

Spearmen相關性分析一般用于對微生物菌群與風味物質間相關性進行初步分析，利用Spearmen相關系數分析了17 種特征風味物質與微生物屬間的相互關系，結果如圖11所示。乳酸桿菌屬和葡萄球菌屬與正己醇M、異丁醇M、正丁醇M、1-戊醇M、異戊醇M、正丁醛、丁酸甲酯、2,6-二甲基吡嗪M、乙酸乙酯D、乙酸甲酯、2-丁醇、2-甲基丁酸乙酯、醋酸、2-庚醇、2,6-二甲基吡嗪D、3-甲基丁酸乙酯M，共16 種風味化合物呈現顯著正相關（P＜0.05）。明串珠菌屬與正己醇M、1-戊醇M、異戊醇M、2,6-二甲基吡嗪M、2-丁醇、2-甲基丁酸乙酯、醋酸、2-庚醇、2,6-二甲基吡嗪D、3-甲基丁酸乙酯M，共10 種風味化合物呈現正相關，這表明乳酸桿菌屬、葡萄球菌屬和明串珠菌屬對酸肉特征風味物質的形成貢獻較大。本研究從屬的水平解析了牛肉酸肉中的微生物菌群組成，并基于屬水平進一步明確了與特征風味物質相關的具體微生物。Yu Honghong等對馬肉腸發酵過程中細菌群落演替及揮發性化合物變化的研究結果表明，乳酸桿菌屬與丁酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯等化合物密切相關，該菌屬相對豐度越大，丁酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯等化合物的含量越大；另外，Hu Yingying等的研究表明，葡萄球菌屬與2-甲基丁酸乙酯的含量呈顯著正相關；Xiao Muyan等的研究發現明串珠菌屬與酯類化合物呈正相關，這與本研究結果趨勢一致。Li Yuxin等在對接種乳酸菌和葡萄球菌混合發酵劑對發酵香腸細菌群落和揮發性風味的影響研究中發現，乳酸桿菌屬在生長過程中能夠將蛋白質和碳水化合物降解為酸和醇，從而導致pH值降低，抑制有害微生物的生長，發酵可以促進酸肉中乙酸乙酯、丁酸乙酯、2-丁醇等香氣物質的積累，提升酸肉整體風味。

5 結論

本研究結合電子鼻、電子舌、GC-IMS和16S rRNA技術探究牛肉酸肉發酵過程中的揮發性風味物質與微生物群落組成的相關性。結果表明：發酵過程中共檢測到40 種揮發性化合物，主要包括醇類、醛類、酸類、酯類等，其中具有顯著差異的揮發性化合物有正己醇、異丁醇、正丁醇等17 種。隨著發酵時間的延長，丁酸甲酯、乙酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯M等酯類物質的含量顯著上升，賦予酸肉特殊的風味。發酵前期酸肉中細菌多樣性較高，隨著發酵時間的延長，厚壁菌門占據絕對優勢，成為發酵酸肉中的優勢門。LEfSe分析發現17 個具有顯著差異種屬，乳酸桿菌屬和魏斯氏菌屬在發酵過程中逐漸取代葡萄球菌屬、產堿桿菌屬等成為發酵酸肉的優勢菌屬。相關性分析發現，乳酸桿菌屬和葡萄球菌屬的豐度與正己醇M、異丁醇M、正丁醇M、1-戊醇M、異戊醇M、正丁醛、丁酸甲酯、2,6-二甲基吡嗪M、乙酸乙酯D、乙酸甲酯、2-丁醇、2-甲基丁酸乙酯、醋酸、2-庚醇、2,6-二甲基吡嗪D、3-甲基丁酸乙酯M的含量呈正相關。該研究結果可為牛肉酸肉風味品質提升和工業化生產工藝改進提供理論依據和數據支持。

作者簡介

通信作者

朱成林，西南民族大學藥學與食品學院副教授， 意大利博洛尼亞大學博士（國家公派），碩士研究生導師，瀘州老窖博士后科研工作站博士后，主要致力于應用多組學技術探究發酵食品風味形成機制和藥食同源食品對腸道菌群及其代謝產物調控機制研究。主持參與國家級、省部級科研項目10余項。以第一作者或通訊作者發表一區TOP論文8篇，二區14篇，任多本SCI期刊青年編委及審稿人。教學上，獲省部級教學競賽三等獎2項、校級教學競賽特等獎2項，獲評校青年教學標兵。同時，積極投身食品健康科普工作，獲2020年全國科普講解大賽優秀獎、四川省2024年科普講解大賽一等獎、第四屆國家民委系統科普講解大賽一等獎，被授予四川省十佳優秀科普使者，成都市雙流區首屆空港科普大使。

第一作者

唐鈺婷，西南民族大學藥學與食品學院2024級研究生，研究方向為食品組學，本科期間參加第九屆“挑戰杯”廣西大學生創業計劃競賽中榮獲銀獎；參加第六屆中國國際互聯網＋大學生創新創業大賽廣西賽區榮獲銅獎。

本文《 牛肉酸肉發酵過程中特征風味物質與微生物群落組成的相關性 》來源于《食品科學》2025年46卷第15期256-239頁，作者： 唐鈺婷，周秉德，楊智博，趙鑫，唐俊妮，胡濱，朱成林 。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250206-014 。點擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關信息。

實習編輯：安宏琳；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

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