《食品科學》：福州大學嚴芬副教授等：海洋來源纖維素酶CelL7的異源表達、酶學表征及生物膜清除作用

纖維素酶是一類能催化水解纖維素生成葡萄糖的復合酶，屬于糖苷水解酶（GH）類，在食品、生物燃料以及生物醫藥等領域發揮著重要作用，它能催化水解纖維素生成葡萄糖、纖維二糖和纖維素低聚糖，屬于GH家族。GH5家族作為最大的GH家族之一，屬于GH-A家族，其催化結構域（CD）因具有典型的（

β/α

） 8 -TIM桶狀折疊結構也被認為屬于4/7超家族，具有雙置換保留型催化機制，該機制涉及兩種催化殘基，通常是谷氨酸或天冬氨酸殘基，一種作為催化酸、堿，另一種作為親核試劑。基于CBMs的功能特點，將不同來源的CBMs與纖維素酶的CD融合重組以開發嵌合酶是改善酶的水解效率的一種有效手段。

生物膜清除技術在食品酶學中的應用是一個重要的研究領域，因為生物膜的形成可能導致食品污染和食品安全問題。傳統的化學消毒方法相比，酶制劑通常更環保，且不易導致微生物產生抗性，是一種綠色安全的生物膜清除方法，能夠提高食品加工的效率和經濟效益。

纖維素酶的多種應用需要尋找新的酶來源，相比陸地來源，海洋來源的酶表現出不同的生物催化特性，如超熱穩定性、高耐鹽性、耐壓性和寒冷適應性等。

福州大學生物科學與工程學院的翁曉敏、胡詩琦和嚴芬*等人使用大腸桿菌異源表達來自海洋菌

Zobellia

sp. B2的新型纖維素酶

CelL7

基因，對纖維素酶基因

CelL7

進行改造，在其C末端添加來自

Bacillus velezensis

sp. L14菌株的碳水化合物結合模塊家族3（

CBM3

）基因，擴增纖維素酶融合基因并表達融合蛋白CelL7-CBM3，同時研究重組纖維素酶CelL7和融合酶CelL7-CBM3對耐藥金黃色葡萄球菌（

Staphylococcus aureu

）和銅綠假單胞菌（

Pseudomonas aeruginosa

）生物膜的清除作用。

01

序列分析和表達純化

來源于

Zobellia

sp. B2的

CelL7

未比對到已公開表征的纖維素酶基因序列，將其上傳至NCBI數據庫命名為B2-CelL7，獲得登錄號（GenBank：OQ790104.1）。

CelL7

基因序列全長1 077 bp，編碼了包含358 個氨基酸殘基在內的多肽鏈，理論蛋白分子質量為40.39 kDa。根據NCBI數據庫中Conserved Domains功能（CD-search）分析纖維素酶CelL7氨基酸序列的結果，表明CelL7只含有1 個纖維素GH5家族CD，缺少CBM。

SOPMA預測分析纖維素酶CelL7二級結構中

-螺旋占32.40%，延伸鏈占17.88%，

-轉角占6.70%，無規卷曲占43.02%，無規卷曲所占比重較大，

-螺旋和延伸鏈比例適中，

-轉角占比最少。

瓊脂糖核酸電泳顯示，

CelL7

（圖1A）與

CelL7-CBM3

（圖1B）條帶大小符合預期且單一。經SDS-PAGE分析，CelL7蛋白條帶位置顯示與預測的理化蛋白分子質量40.39 kDa結果一致，融合蛋白CelL7-CBM3的大小為50 kDa左右（圖2）。

02

CelL7和CelL7-CBM3的活力及酶學性質

通過DNS法測定酶活性，重組纖維素酶CelL7和CelL7-CBM3的比酶活力分別為2 249.81 U/mg和2 915.75 U/mg，融合了CBM3結合結構域后比活力提高了0.3 倍。研究表明，CBM結構域主要發揮3 種作用：將酶靶向底物、增加酶與底物的接近性、結晶型底物有一定的破壞作用。CBM結構域的核心作用在于識別并特異性地與不溶性纖維素進行結合，這種結合將纖維素酶的CD引導至纖維素底物，從而增強了纖維素酶對底物的親核性以及水解活性。CBM結構域能夠與纖維素葡萄糖單元表面對齊，該結合可能是由氨基酸側鏈和與多糖表面的骨架位點之間的氫鍵驅動，能夠使得纖維素酶能夠更加緊密地與底物結合，提升了底物上的有效酶濃度，促進酶-底物的相互作用，從而顯著提高催化效率。Li Xiangqian等將內切葡聚糖酶基因

Endo5

、外切葡聚糖酶基因

Exo5

和不同的CBMs融合生成多種雙功能纖維素酶基因，融合酶Endo5-2CBM-Exo5對微晶纖維素的比活力比親本CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28提高了2.2～14.0 倍，在85 ℃孵育2 h后融合酶的相對活性保持在45%～68%，表現出較好的熱穩定性。

如圖3所示，以CMC-Na為底物反應，CelL7與CelL7-CBM3在50 ℃時表現出最高酶活力。在40～55 ℃孵育1 h后，CelL7可保持在80%以上的相對酶活力；隨著溫度上升，CelL7的熱穩定性逐漸下降；在60 ℃孵育1 h后，CelL7的相對酶活力降至20%以下。由此可見當溫度在40～55 ℃范圍內時，CelL7能維持較高的活力，具有較好的熱穩定性，表明CelL7是一種中溫纖維素酶。將CelL7-CBM3于40～55 ℃孵育45 min后，仍保持80%的初始酶活力。與CelL7相比，在C末端添加結合結構域后的融合酶CelL7-CBM3在不同溫度下的熱穩定性差異不大。有研究表明纖維素酶的最適反應溫度范圍為40～55 ℃，如來源于

Aureobosidium pullulans

98的CMCase最適反應溫度為40 ℃；來源于細菌B.

subtilis

IAJ3的內切葡聚糖酶Cel-A在50 ℃條件下活力最高，且在30～60 ℃范圍內相對酶活保持在88%以上，表明該酶在常溫條件下具有較高的活力。從

Talaromyces leycettanus

JCM12802的基因組中挖掘出的GH5家族內切葡聚糖酶TlCel5在50 ℃條件下處理30 min后剩余酶活力為71.5%，處理1 h酶活力僅剩56.4%，而在60 ℃和70 ℃分別處理5 min和2 min剩余酶活力驟降至0%。Harshvardhan等從海洋芽孢桿菌H1666中分離出純化的纖維素酶也表現了一定耐熱性，在60 ℃條件下孵育4 h的剩余活力為40%。

如圖4A所示，CelL7在pH 5.0時酶活力最高，其中在pH 3.5～7.5范圍內相對酶活力均維持在80%以上，表明CelL7是一種嗜酸性酶。融合酶CelL7-CBM3與CelL7的最適反應pH值相近，在pH 5.5時達到最高酶活力，在pH 3.0～7.0范圍內相對酶活力維持在80%以上，而在pH 8.0～11.0的堿性條件下反應酶活力均下降至60%以下，表明該酶適合在酸性環境下反應。這與來自糖苷GH5的重組纖維素酶CMC-1水解羧甲基纖維素的結果相似，其在pH 5.0和50 ℃時具有最大活性。研究表明海洋纖維素酶最適反應pH值在4.5～8.0范圍內，在弱酸性范圍內具有最大活性。如來源海洋芽孢桿菌屬細菌分泌的耐鹽纖維素酶Bc22Cel的最佳pH值和溫度分別為6.5和60 ℃。

如圖4B所示，在pH 3.0～11.0的條件下孵育2 h后，CelL7能保持60%以上的相對酶活力，表明CelL7具有廣泛pH值穩定性；其中在pH 4.0～6.5的范圍內孵育2 h后相對酶活力保持在80%以上。在pH 4.0～8.0的條件下孵育2 h后，融合酶CelL7-CBM3的相對酶活力保持在80%以上，相比CelL7，添加結合結構域提高了酶在堿性環境下的pH值穩定性。Cattaneo等通過將熱纖梭菌的內切纖維素酶CtLic26A-Cel5E的CBM添加到耐熱內切葡聚糖酶的C末端設計出嵌合蛋白Dtur CelA。融合蛋白在結晶纖維素上比天然酶表現出更高的活性，CBM的添加增加了纖維素酶在極端pH值條件下的穩定性。

如圖5所示，1.0、5.0 mmol/L和10.0 mmol/L的Mn2+以及10.0 mmol/L的Fe2+對CelL7活力有明顯的激活作用，相對酶活力可提高30%左右；同時1.0 mmol/L的Fe2+、Li+對CelL7的催化過程有微弱的促進作用，而Mg2+、Ba2+、Co2+、Ni2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+對CelL7活力表現出不同程度的抑制作用，表面活性劑SDS和EDTA對CelL7的活力也呈現類似的規律，并且隨著離子濃度的增加抑制程度逐漸增大，其中Cu2+的存在對CelL7的活力抑制作用最為明顯，在Cu2+濃度為5.0 mmol/L和10.0 mmol/L時完全抑制CelL7活力。結果表明CelL7不屬于金屬蛋白，加入微量Mn2+、Fe2+和Li+可以提高其活力。類似的結果也出現在曲霉ZJUBE-1菌株純化的纖維素酶，其在Fe2+和Mn2+的存在下活力顯著增強，而Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ba2+、Ag2+、Hg2+和EDTA則限制了纖維素酶活力；有所不同的是，來源于

A. pullulans

98的CMCase能被Fe 2+ 、Cu 2+ 和Mg 2+ 激活，而Mn 2+ 、Fe 3+ 、Ba 2+ 等離子可抑制其活性。

03

CelL7的底物特異性

選取CMC-Na、纖維二糖、Avicel、木聚糖、昆布多糖、葡聚糖、殼聚糖和麥芽糖作為反應底物，研究CelL7的底物特異性。如圖6所示，CelL7對CMC-Na、纖維二糖和木聚糖均表現出一定的水解能力，而對結晶性纖維素Avicel、昆布多糖、葡聚糖、殼聚糖和麥芽糖無明顯降解作用，表明CelL7主要水解

-1,4-糖苷鍵，不能作用于

-1,3-1,4-糖苷鍵、

-1,3或

-1,6糖苷鍵，對于微晶纖維素Avicel作用弱也表明其不能作用于

-糖苷鍵。由此可見重組纖維素酶CelL7具有內切葡聚糖酶和

-葡聚糖酶活性，而無外切葡聚糖酶活性。來自GH5家族的重組纖維素酶KG51同樣表現出對

-1,4-糖苷鍵的活性，對CMC、

-甘露聚糖和山毛櫸木聚糖的酶活性高于

-1,3-1,4-糖苷鍵、

-1,3或

-1,6糖苷鍵的底物的酶活性。然而同屬同一家族的酶也具有不同的底物特異性，從

Thermobifida alba

AHK119中克隆表達的內切葡聚糖酶AHK119-E5對不溶性纖維素底物的活性高于對可溶性纖維素底物的活性，這與其CD和CBM的氨基酸序列有一定聯系。

04

動力學參數測定

CelL7和CelL7-CBM3的Lineweaver-Burk曲線見圖7，經計算，CelL7-CBM3對CMC-Na的米氏常數

K

m 為11.70 mg/mL，較CelL7的

K

m （13.23 mg/mL）有所降低，表明添加結合結構域后的融合酶對CMC-Na的親和力增強；最大反應速率

V

max 為175.44 mg/（mL·min），催化常數

K

cat 為2.78 s -1 ，

K

cat /

K

m 為0.24 mL/（mg·s），與CelL7相比變化不大。事實證明，纖維素酶結合結構域的缺失對于可溶性纖維素如CMC-Na的降解影響不大。

表2為以CMC-Na為底物時CelL7和CelL7-CBM3的比活力及動力學參數。相同的酶活力單位定義下，CelL7-CBM3對CMC-Na的比活力為2 915.76 U/mg，相比原酶的2 249.81 U/mg有所提高。綜合上述的分析結果，可知添加結合結構域能提高重組融合酶對底物的催化作用。

05

CelL7和CelL7-CBM3對生物膜的分散作用

如圖8所示，將抗藥金黃色葡萄球菌培養48 h后，通過結晶紫染色法測定添加重組纖維素酶CelL7和CelL7-CBM3后殘留的未分散生物膜量，與對照組相比，質量濃度為5.0～60.0 μg/mL的CelL7和10.0～60.0 μg/mL的CelL7-CBM3對S.

aureus

生物膜具有顯著的分散作用（

P

＜0.001），兩種重組纖維素酶對于生物膜的分散效果均隨著質量濃度的增加而增加，但相同質量濃度下重組酶CelL7較融合酶CelL7-CBM3的分散效果更好。

如圖9所示，將銅綠假單胞菌

P. aeruginosa

培養48 h后，通過結晶紫染色測定添加重組纖維素酶CelL7和CelL7-CBM3后殘留的未分散生物膜量，與對照組相比，質量濃度為10.0～60.0 μg/mL的重組酶CelL7和30.0～60.0 μg/mL的CelL7-CBM3對

P. aeruginosa

生物膜具有顯著的分散作用（

P

＜0.001），同時5.0 μg/mL的CelL7較對照組具有一定的分散作用（

P

＜0.01），而5.0 μg/mL和10.0 μg/mL的CelL7-CBM3不能有效分散

P. aeruginosa

生物膜。相同質量濃度下重組酶CelL7較融合酶CelL7-CBM3對

P. aeruginosa

分散效果更好。因此，重組酶CelL7和CelL7-CBM3可以有效分散銅綠假單胞菌生物膜。有研究表明生長在生物膜中的微生物細胞對抗生素和宿主免疫反應的耐受性是浮游細胞的1 000 倍。纖維素酶對細菌生物膜的降解可能是由于多糖的水解和生物膜結構的破壞，從而增加了浮游細胞的擴散。Kamali等研究發現1.25、2.5、5.0 U/mL和10.0 U/mL的纖維素酶與頭孢他啶聯用可以導致銅綠假單胞菌生物膜顯著減少。

06

結 論

纖維素酶是一類能催化水解纖維素生成葡萄糖的復合酶，屬于GH類，在食品、造紙制漿、生物燃料以及生物醫藥等領域發揮著重要作用。本研究從海洋細菌

Zobellia

sp. B2中克隆得到新型纖維素酶

CelL7

基因，CD-search分析結果表明CelL7只含有1 個CD，缺少CBM。

CelL7

基因序列全長1 077 bp，編碼358 個氨基酸殘基，理論蛋白分子質量為40.39 kDa。CelL7和CelL7-CBM3的比酶活力分別為2 249.81 U/mg和2 915.75 U/mg。

酶學性質研究結果表明，CelL7與CelL7-CBM3的最適反應溫度基本一致，均為50 ℃。溫度在40～55 ℃范圍內時，CelL7能維持較高的酶活力，具有較好的熱穩定性，表明CelL7是一種中溫纖維素酶。CelL7與CelL7-CBM3的最適pH值分別為5.0和5.5，CelL7在pH值為4.0～6.5的范圍內相對酶活力均維持在80%以上，而CelL7-CBM3在pH值為4.0～8.0的范圍內相對酶活力能夠維持在80%以上，具有較好的pH值穩定性。Mn2+和Fe2+能激活CelL7活力，5.0 mmol/L和10.0 mmol/L的Cu2+對CelL7活力有明顯的抑制作用。底物特異性結果顯示，CelL7可降解CMC-Na、纖維二糖和木聚糖，表明CelL7主要作用于

-1,4-糖苷鍵，屬于內切葡聚糖酶。以CMCNa為底物時，CelL7-CBM3的

K

m 為11.70 mg/mL，較CelL7的

K

m （13.23 mg/mL）有所降低，表明添加結合結構域后的融合酶對CMC-Na的親和力增強；CelL7-CBM3的最大反應速率

V

max 為175.44 mg/（mL·min），催化常數

K

cat 為2.78 s -1 ，

K

cat /

K

m 為0.24 mL/（mg·s），較CelL7相比變化不大。

生物膜清除實驗表明，5.0～60.0 μg/mL的CelL7和CelL7-CBM3能夠有效分散生物膜，減少生物膜量。因此，重組酶CelL7和CelL7-CBM3可以有效分散銅綠假單胞菌生物膜，具有作為酶制劑清除生物膜應用于食品安全加工的潛力。

本文《海洋來源纖維素酶CelL7的異源表達、酶學表征及生物膜清除作用》來源于《食品科學》2025年46卷第6期124-132頁，作者：翁曉敏，胡詩琦，蔡佳琪，洪健渠，嚴芬*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240904-031。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。

實習編輯：普怡然；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網