《食品科學》：中國農業大學江正強教授等：大腸桿菌利用葡萄糖生物合成D-阿洛酮糖的途徑構建及優化

D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向異構體，是自然界中天然存在但含量極少的一種稀有功能單糖。D-阿洛酮糖作為一種還原性的己酮糖，具有蔗糖70%的甜度，但僅有0.4 kal/g的能量值（蔗糖為3.89 kal/g），被認為是一種優良的蔗糖替代品。高效制備D-阿洛酮糖已成為研究熱點。

D-阿洛酮糖的制備方法主要有化學法、酶法以及生物合成法。生物合成法是一種新興的D-阿洛酮糖制備方法，通過調控生物體內代謝途徑以廉價底物為原料發酵生產D-阿洛酮糖。相較于其他兩種方法，生物合成法更具有經濟性和高效精準性，是制備D-阿洛酮糖最有潛力的方法。

微生物合成D-阿洛酮糖的路徑分為兩種，一種是在酮糖3-差向異構酶作用下，通過“Izumoring”策略將D-果糖異構化為D-阿洛酮糖，通過增加D-果糖的轉運及減少D-阿洛酮糖的消耗和外排，將D-阿洛酮糖產量提高至32.3 g/L。第二種路徑是基于“磷酸化-去磷酸化”策略，將D-葡萄糖或D-果糖磷酸化后通過D-阿洛酮糖-6-磷酸3-差向異構酶（AlsE）將D-果糖-6-磷酸（F6P）轉化為D-阿洛酮糖-6-磷酸（P6P），最后由阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶（A6PP）不可逆地將P6P轉化為D-阿洛酮糖并排出細胞。

目前D-阿洛酮糖的生物合成主要針對通路構建、精準優化前體物質的供應以及保證輔因子的供給等策略，但D-阿洛酮糖的發酵產量水平較低。因此，提高合成通路中的關鍵酶A6PP的活性、平衡合成通路中基因表達強度等是提高D-阿洛酮糖產量和降低成本的關鍵。

中國農業大學食品科學與營養工程學院的姜雅文、張蒼萍、江正強*等通過在大腸桿菌中過表達

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磷酸化-去磷酸化策略構建合成

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首先構建了“磷酸化-去磷酸化”策略合成D-阿洛酮糖的通路（圖1a）。重組質粒pRSFDuet-alsE-hxpB和pETDuet-galp-glk分別導入大腸桿菌BL21（DE3）和大腸桿菌JM109（DE3）中，分別得到重組菌株BE-1和JE-1。結果表明，菌株BE-1和JE-1發酵48 h后都可以檢測出D-阿洛酮糖，其中菌株BE-1產量較高，為0.29 g/L（圖1b）。因此選擇大腸桿菌BL21（DE3）作為本研究生物合成D-阿洛酮糖的初始底盤菌株。但BE-1和JE-1的OD600＜1.2，說明生長狀況較差，說明D-阿洛酮糖合成通路的加強影響了重組菌株的正常生長，因此需要對BE-1生長及D-阿洛酮糖合成通路碳通量進行調整。

在大腸桿菌中理論上存在可以將D-葡萄糖轉化為D-阿洛酮糖的合成通路。然而大腸桿菌BL21（DE3）和大腸桿菌JM109（DE3）在含有葡萄糖的M9培養基中發酵后并未檢測到D-阿洛酮糖的生成。這是由于中間產物F6P的主要代謝途徑是糖酵解，導致D-阿洛酮糖無法積累。D-葡萄糖可以被半乳糖/氫離子協同轉運蛋白（GalP）轉運，由葡萄糖激酶（Glk）磷酸化為D-葡萄糖-6-磷酸（G6P），將半乳糖/氫離子協同轉運蛋白基因galp和葡萄糖激酶基因glk作為葡萄糖攝取模塊，與D-阿洛酮糖生產模塊（包括alsE和a6pp）共同加強表達，加強合成通路的碳通量，初步實現大腸桿菌利用葡萄糖合成D-阿洛酮糖。

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大腸桿菌生物合成

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敲除競爭代謝路徑中酶基因對大腸桿菌生長及其合成D-阿洛酮糖產量的影響見圖2。敲除了一系列與G6P、F6P和P6P代謝相關的內源性基因，包括磷酸果糖激酶A基因pfkA、磷酸果糖激酶B基因pfkB、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因zwf、磷酸葡萄糖變位酶基因pgm、阿洛糖-6-磷酸異構酶基因rpiB和甘露糖-6-磷酸異構酶基因manA，從而產生了攜帶質粒pRSFDuet-alsE-hxpB和pETDuetgalp-glk的菌株BE-2（大腸桿菌BL21（DE3）ΔpfkA）、BE-3（大腸桿菌BL21（DE3）ΔpfkB）、BE-4（BE-2Δzwf）、BE-5（BE-2Δpgm）、BE-6（BE-4ΔrpiB）和BE-7（BE-6ΔmanA）。結果表明，重組菌株BE-2的D-阿洛酮糖產量提升至0.38 g/L。重組菌株BE-4的D-阿洛酮糖產量提升至0.72 g/L，而重組菌株BE-5的D-阿洛酮糖的產量沒有明顯變化。重組菌株BE-6的D-阿洛酮糖產量提升至0.81 g/L，重組菌株BE-7的D-阿洛酮糖產量提升至0.95 g/L。此外，在敲除pfkA、zwf、pgm、rpiB和manA基因后，重組菌株的OD600均大于6，說明其恢復正常生長。

G6P、F6P和P6P是通過“磷酸化-去磷酸化”策略合成D-阿洛酮糖的3 個關鍵中間產物。大腸桿菌中F6P優先通過磷酸果糖激酶A和B（由pfkA和pfkB編碼）轉化為D-果糖-1,6-二磷酸而不是用于D-阿洛酮糖合成，因此分別敲除了pfkA和pfkB基因。由于pfkA基因所編碼的磷酸果糖激酶A占磷酸果糖激酶活性的90%，因此敲除后更多的F6P用于D-阿洛酮糖的生產，從而提高了D-阿洛酮糖的產量。在合成過程中，葡萄糖的有效利用對于D-阿洛酮糖的合成至關重要。G6P可通過大腸桿菌中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和磷酸葡萄糖變位酶代謝進入戊糖磷酸途徑和糖原合成途徑，因此，基因zwf和pgm被進一步敲除，其中敲除zwf基因后，D-阿洛酮糖產量明顯提升。P6P會被阿洛糖-6-磷酸異構酶（由rpiB編碼）轉化進入阿洛糖降解途徑，因此可通過敲除rpiB基因防止P6P的降解，從而增加D-阿洛酮糖的產量。除此之外，甘露糖-6-磷酸異構酶（ManA）可以將F6P和D-甘露糖-6-磷酸可逆異構化，因此通過敲除manA基因防止碳代謝流失，增加D-阿洛酮糖的產生。在消除競爭通路相關基因后，本研究的重組菌株BE-7的D-阿洛酮糖產量明顯提升至0.95 g/L。

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不同來源的A6PP對大腸桿菌生物合成

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將脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）來源的BfA6PP、諾氏擬桿菌（B. nordii）來源的BnA6PP、糞蠅科擬桿菌（B. faecichinchillae）來源的BfaA6PP、布氏擬桿菌（B. bouchesdurhonensis）來源的BbA6PP和糞擬桿菌（B. faecalis）來源的BfisA6PP分別替換重組菌種BE-7中的HxpB，構建重組菌BE8～BE12。搖瓶發酵結果如圖3所示，重組菌株BE8～BE12生物合成的D-阿洛酮糖產量分別為1.16、1.19、1.08、1.21 g/L和1.05 g/L，且重組菌株生長狀況良好（OD600＞6）。其中布氏擬桿菌來源的BbA6PP在發酵后D-阿洛酮糖產量最高，為1.21 g/L。

在“磷酸化-去磷酸化”策略中，由A6PP將P6P轉化為D-阿洛酮糖為不可逆反應，因此高活性A6PP有利于反應的進行，進而提高D-阿洛酮糖的產量。篩選活性更高的A6PP對高效合成D-阿洛酮糖至關重要。Guo Qiang等選擇了脆弱擬桿菌（B. fragilis）來源的A6PP，D-阿洛酮糖產量為0.07 g/L。Taylor等篩選了大腸桿菌對P6P具有潛在活性的磷酸酶，在大腸桿菌中可產生0.55 g/L的D-阿洛酮糖。本研究篩選的布氏擬桿菌來源的BbA6PP相較于其他已報道的A6PP而言具有更高的D-阿洛酮糖合成能力，構建的菌株BE-11生物合成D-阿洛酮糖產量達1.21 g/L，比重組菌株BE-7產量提高了27.4%。因此，利用菌株BE-11進行進一步優化。

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調節通路基因表達水平對大腸桿菌合成

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galp和glk基因可作為葡萄糖攝取模塊，alsE和Bba6pp基因可作為D-阿洛酮糖生產模塊，選用3 個不同拷貝數的質粒pCDFDuet-1（低拷貝）、pETDuet-1（中拷貝）和pRSFDuet-1（高拷貝）優化4 個基因的表達水平。將這兩個模塊的基因分別連接到不同拷貝數的質粒上，不同拷貝數重組質粒兩兩組合，分別導入底盤細胞中，獲得5 個重組菌BE13～BE17（圖4a）。搖瓶發酵結果如圖4b所示，優化通路基因的轉錄水平后，D-阿洛酮糖的產量存在不同程度的提高，其中重組菌BE-14的D-阿洛酮糖產量最高，為2.06 g/L，且菌株生長狀況良好（OD600＞5）。

大腸桿菌編碼通路中的酶基因應當在適當平衡的水平上表達，以避免導致生長抑制或目標產物產量低的有毒中間產物積累。質粒拷貝數的優化是常用方法之一，成功地應用于改善脂肪酸、羥酪醇和2′-巖藻糖基乳糖的生產。在D-阿洛酮糖生物合成過程中，葡萄糖的攝取和阿洛酮糖的合成是實現D-阿洛酮糖高水平生產的關鍵。先前研究表明，D-阿洛酮糖生產模塊基因alsE和a6pp以較高水平表達可以達到D-阿洛酮糖的最大產量。本研究通過優化質粒拷貝數，在高拷貝數質粒中表達葡萄糖攝取模塊基因galp和glk、中拷貝數質粒中表達D-阿洛酮糖生產模塊基因alsE和Bba6pp情況下有利于D-阿洛酮糖的合成，重組菌合成D-阿洛酮糖產量提升至2.06 g/L（圖4b）。

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搖瓶發酵條件對重組菌株生物合成

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為進一步提高D-阿洛酮糖的發酵水平，進行工程菌株BE-14的發酵條件優化，結果見圖5。葡萄糖添加量為25 g/L時，D-阿洛酮糖產量最高，為2.08 g/L（圖5a），葡萄糖添加量為15 g/L時，菌株OD600最高，為7.75。IPTG濃度為0.2 mmol/L時，D-阿洛酮糖產量最高，為2.22 g/L（圖5b），IPTG濃度為0.5 mmol/L時，菌株OD600最高，為7.79。BE-14在30 ℃和37 ℃條件下發酵，D-阿洛酮糖產量最高，分別為2.06 g/L和2.12g/L（圖5c），而25 ℃時，D-阿洛酮糖產量及菌體OD600最低，為1.18 g/L和1.27。經過多因素組合優化，葡萄糖添加量為25 g/L、IPTG濃度為0.2 mmol/L和30 ℃發酵時D-阿洛酮糖產量最高，為2.72 g/L（圖5d），比優化前提高了32%。

誘導劑濃度、底物濃度和培養溫度等發酵條件在微生物發酵合成中具有重要作用。經單因素條件優化，發現當葡萄糖添加量為5～25 g/L時，隨著葡萄糖添加量的增加，D-阿洛酮糖產量逐漸增加；葡萄糖添加量為30 g/L時的D-阿洛酮糖產量（2.05 g/L）與葡萄糖添加量為25 g/L時D-阿洛酮糖的產量（2.08 g/L）差別不大。葡萄糖是大腸桿菌生長的碳源和D-阿洛酮糖生物合成的底物，結果表明，隨著葡萄糖添加量的增加，在保證菌株正常生長的情況下用于D-阿洛酮糖合成的葡萄糖逐漸增加，從而增加D-阿洛酮糖的產量；當葡萄糖添加量為25 g/L時，D-阿洛酮糖合成途徑可能已達到其最大生產能力，此時進一步增加葡萄糖添加量（如30 g/L）不會繼續提高D-阿洛酮糖產量。誘導劑IPTG是影響工程菌株生物合成D-阿洛酮糖的另一重要因素。適當的IPTG濃度不僅可以減輕再生核苷酸輔因子（ATP和三磷酸鳥苷）的代謝負擔，而且可以平衡途徑基因的表達水平，從而提高D-阿洛酮糖的產量。發酵溫度優化顯示，最適培養溫度在30 ℃和37 ℃。Guo Yan等通過溫度優化發現在25～37 ℃的生物催化活性和溫度之間存在正相關，當溫度繼續升高達到50 ℃時，相對活性＜40%。因此適當的培養溫度有利于酶的表達，進而提升D-阿洛酮糖的產量。因此，葡萄糖添加量為25 g/L、IPTG濃度為0.2 mmol/L時，在30 ℃發酵是工程菌株BE-14生物合成D-阿洛酮糖的最適發酵條件（圖5d）。

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5 L發酵罐中分批補料精準發酵生物合成

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重組菌BE-14在5 L發酵罐進行了分批補料發酵實驗，發酵結果如圖6所示。發酵10 h后，OD600值達到27.3，此時加入IPTG和葡萄糖用于D-阿洛酮糖的合成。15～35 h菌體生長較緩，35 h后菌體OD600又迅速增加，發酵46 h時，D-阿洛酮糖的產量達到最高，為18.4 g/L。發酵液中僅存在微量葡萄糖（0.7 g/L）及果糖（0.1 g/L）殘留（數據未顯示）。

分批補料精準發酵能更好的體現重組菌株BE-14合成D-阿洛酮糖的能力。經分批補料發酵，重組菌BE-14合成D-阿洛酮糖的產量為18.4 g/L，是目前以葡萄糖為底物采用生物合成法的最高水平。誘導前菌株BE-14快速消耗葡萄糖用于菌體生長，細胞生長量達到峰值后處于穩定狀態，說明菌體在發酵過程中生長狀況較好。15～35 h菌體生長較緩，但D-阿洛酮糖生成速度明顯加快，說明該階段葡萄糖更多的用于D-阿洛酮糖的生物合成而不是細胞生長。35 h后菌體OD600又迅速增加，同時D-阿洛酮糖的合成速率降低并趨于平緩。Guo Qiang等采用以果糖為底物通過“Izumoring”策略生產D-阿洛酮糖，產量為32.33 g/L，但果糖殘留多且菌株生長狀況差。Taylor等采用全細胞催化法，通過過表達大腸桿菌內源AlsE和己糖醇磷酸酶B，D-阿洛酮糖產量達到15.3 g/L。本研究通過篩選高效A6PP等策略，保證菌株正常生長下進行D-阿洛酮糖的高效生物合成，產物中葡萄糖和果糖殘留很少，有利于D-阿洛酮糖后續的提取及純化。

結論

本研究在大腸桿菌BL21（DE3）中構建了“磷酸化-去磷酸化”途徑合成D-阿洛酮糖的通路，敲除競爭途徑相關基因（pfkA、zwf、rpiB和manA基因），更多的D-葡萄糖用于合成D-阿洛酮糖。挖掘出合成D-阿洛酮糖效果較好的布氏擬桿菌來源的BbA6PP。采用中拷貝質粒表達D-阿洛酮糖生產模塊基因alsE和Bba6pp、高拷貝數質粒表達葡萄糖攝取模塊基因galp和glk的重組菌株BE-14在分批補料精準發酵生產的D-阿洛酮糖產量為18.4 g/L，產物中僅存在微量葡萄糖及果糖。本實驗對實現生物合成D-阿洛酮糖工業化生產具有一定現實意義。

作者簡介

通信作者：

江正強，男，漢族，中共黨員，中國農業大學食品科學與營養工程學院教授，博士生導師，長江學者特聘教授，國家杰出青年科學基金獲得者。入選國家百千萬工程有突出貢獻中青年專家、國務院政府特殊津貼、國家“萬人計劃”領軍人才、農業科研杰出人才及其創新團隊、科技部中青年科技創新領軍人才、光華工程科技獎、中國青年科技獎、教育部新世紀優秀人才、全國優秀百篇博士論文等。現為中國輕工食品生物工程重點實驗室主任，中原食品實驗室常務副主任，國家重點研發計劃首席科學家。1995年參加工作，2004年晉升為教授。曾在日本、法國、德國等進行長期交流合作研究。現任中國農業工程學會農產品加工及貯藏工程分會理事長、中國食品科學技術學會酶制劑分會副理事長、中國發酵產業協會酶制劑和益生元分會副理事長、中國食品工業協會常務理事等，兼任《Food Chemistry》和《食品科學》等多種期刊編委。主要研究方向食品生物技術、食品酶與發酵工程、營養健康食品等。發表學術論文300多篇，其中SCI收錄論文200多篇，著有專著6 部，授權發明專利70多項。榮獲國家科技進步二等獎2 項、國家科技發明二等獎1 項、光華工程科技獎2 項、中國青年科技獎1 項和多項省部級獎勵。

第一作者：

姜雅文，女，（1997—），中國農業大學博士，研究方向為食品合成生物學。

本文《大腸桿菌利用葡萄糖生物合成

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實習編輯：南伊；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

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