JACS：亞胺還原酶催化不對稱合成軸手性芳基酰胺類分子

導讀

近日，中國醫學科學院/北京協和醫學院醫藥生物技術研究所付海根課題組與宋丹青課題組合作，利用亞胺還原酶（IREDs）催化的動態動力學拆分策略，首次實現了軸手性芳基酰胺類分子的酶催化不對稱合成，相關研究成果發表于J. Am. Chem. Soc.。

軸手性分子作為一類優勢骨架，在天然產物、藥物化學、不對稱催化及材料科學等多個研究領域展現出廣闊的應用前景。除最為常見的聯芳基軸手性結構外，非聯芳基類阻轉異構體，如酰胺、苯乙烯、苯胺及酰亞胺等化合物，因其獨特的軸向手性以及多樣化的功能，近年來受到廣泛關注（圖1A）。其中，芳基酰胺類化合物因Caryl–Camide鍵的旋轉受限而表現出穩定的軸手性，在生物活性分子的構建及不對稱催化等領域具有重要應用價值。然而，該類軸手性芳基酰胺的不對稱催化合成策略仍不夠成熟，其主要挑戰在于Caryl–Camide鍵的旋轉能壘相對較低，使得該手性軸的立體化學控制與構型保持變得尤為困難。

近年來，生物催化在構建軸手性分子領域取得顯著進展，多種酶催化劑—從傳統脂肪酶、酮還原酶到亞胺還原酶、烯烴還原酶、細胞色素P450乃至人工金屬酶—已被成功應用于軸手性分子的不對稱合成。然而，現有研究多集中于經典的聯芳基骨架體系，針對軸手性酰胺的酶催化構建方法仍無報道（圖1B）。

近日，中國醫學科學院/北京協和醫學院醫藥生物技術研究所付海根課題組與宋丹青課題組合作，利用亞胺還原酶（IREDs）催化的動態動力學拆分策略，首次實現了軸手性芳基酰胺類分子的酶催化不對稱合成。該DKR過程包含兩個關鍵步驟：首先，鄰位含有醛基的芳香酰胺底物（rac-4a）可借助酰胺氮原子的孤對電子與醛基之間產生n→π相互作用，有效降低手性軸的旋轉能壘，促使底物快速消旋；隨后，IREDs通過高度立體選擇性地還原其中一種亞胺對映體，最終高效生成光學純的芳香酰胺類軸手性產物（圖1C）。

圖1. 生物催化合成芳基酰胺類化合物。圖片來源：J. Am. Chem. Soc.

作者首先以消旋萘甲酰胺醛4a與芐胺5a作為模板底物，對一系列野生型亞胺還原酶（IREDs）進行篩選，發現來源于Kutzneria albida的IRED-68雖在初步篩選中活性較低（產率10%），但對目標產物表現出優異的立體選擇性（96:4 er）。為進一步提升催化效率，研究團隊解析了IRED-68的蛋白晶體結構，并基于結構信息對其活性中心的13個關鍵殘基進行了迭代飽和突變，最終獲得四重突變體 IRED-68-M4（V123Q/S233G/V232H/A122T）。該突變體相較于野生型蛋白，比活性提高了135倍。在后續反應優化中，采用粗酶凍干粉（4 mg/mL）并添加表面活性劑TPGS-750-M（2 wt%），模型反應的產率可提高至94%，對映選擇性達到99:1 er。

圖2. 模板反應篩選與優化。圖片來源：J. Am. Chem. Soc.

隨后，作者對突變體IRED-68-M4的底物適用范圍進行了系統評估（圖3）。結果表明，該突變體具有良好的底物兼容性，可高效催化多種取代芐胺、雜環取代甲胺、苯乙胺及苯胺等胺類底物。除萘甲酰胺（6–36）結構外，該酶對苯甲酰胺衍生物（37–40）也表現出較高催化活性，多數底物可獲得70%–98%的產率，并保持優異的對映選擇性（最高er > 99:1）。此外，研究團隊成功實現了化合物10的克級規模制備，以84%的產率獲得1.28 g目標產物（98:2 er），進一步證明了該方法在合成應用中的潛力。

圖3. 底物范圍拓展。圖片來源：J. Am. Chem. Soc.

最后，作者結合X射線晶體學與分子對接分析，揭示了IRED-68-M4突變體催化性能提升的機制。研究發現，突變位點V123Q可與還原型輔因子NADPH的煙酰胺環形成額外氫鍵，從而可能增強與輔因子的結合能力。ITC結合實驗進一步證實，突變體IRED-68-M4對NADPH的結合能力顯著高于野生型IRED-68-WT（KD = 4.1 μM vs. 27.4 μM）。分子對接結果表明，V232H位點可與亞胺底物42的苯環產生π–π相互作用，而S233G位點則擴大了活性中心空腔，有利于大體積底物的結合與進入。此外，通過單位點突變實驗，作者鑒定出D170為潛在的質子給體（圖4）。

圖4. 結構及機理解析。圖片來源：J. Am. Chem. Soc.

總結

本研究基于動態動力學拆分策略，首次實現了軸手性芳基酰胺類分子的生物催化不對稱合成。通過高效的蛋白質工程改造，成功獲得了催化性能優異的IRED-68-M4突變體，該酶兼具高活性、高對映選擇性及廣泛的底物適用性，為構建非聯芳基軸手性分子提供了新型酶催化工具。該研究成果發表于J. Am. Chem. Soc.，中國醫學科學院/北京協和醫學院醫藥生物技術研究所博士研究生姚周暢和孟潤澤為本文共同第一作者；黃玲博士、宋丹青研究員、付海根研究員為共同通訊作者。研究過程中，楊兆勇課題組為本工作提供了重要支持。

Zhouchang Yao, Runze Meng, Zitian Zhou, Luyao Yu, Zhiyun Wu, Longqing Tang, Tianzhang Qiao, Ke Li, Ling Huang,* Danqing Song,* Haigen Fu.*Engineering an Imine Reductase for Enantioselective Synthesis of Atropisomeric Amides. J. Am. Chem. Soc., 2025, https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c12724.

博后招聘、博士生招生信息

付海根，現任中國醫學科學院/北京協和醫學院醫藥生物技術研究所研究員，主要從事生物催化與藥物化學研究。近年來以第一或通訊作者在Nature、Nature Catalysis、JACS、Angewandte Chemie等國際高水平期刊發表論文十余篇，并于2022年入選國家高層次青年人才計劃。

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