FSHW | 預(yù)防性治療副干酪乳桿菌K56通過(guò)調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸產(chǎn)生和Treg分化來(lái)改善哮喘

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Introduction

過(guò)敏性哮喘（Allergic asthma）是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高且呈逐年上升趨勢(shì)。“腸-肺軸”概念的提出及相關(guān)臨床及實(shí)驗(yàn)研究均顯示，腸道微生物群在哮喘發(fā)病過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，調(diào)節(jié)腸道微生物群能夠有效緩解哮喘癥狀。益生菌作為一種活性微生物，能夠通過(guò)恢復(fù)腸道微生物群平衡和調(diào)節(jié)其代謝產(chǎn)物發(fā)揮預(yù)防或治療疾病的作用。研究表明，短鏈脂肪酸（SCFAs）作為“腸-肺軸”的重要介質(zhì)，可以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的分化，減少胃腸道和氣道疾病的炎癥反應(yīng)。

副干酪乳桿菌K56是由伊利集團(tuán)自主研發(fā)的專屬菌株，是一種分離自中國(guó)健康嬰兒腸道的可食用益生菌，已被應(yīng)用于食品工業(yè)并開發(fā)出多款乳制產(chǎn)品。有報(bào)道稱K56可影響肥胖小鼠微生物群結(jié)構(gòu)從而改善肥胖體征。由于肥胖可能是哮喘風(fēng)險(xiǎn)增加的一個(gè)因素，個(gè)性化的飲食干預(yù)可能會(huì)改善呼吸道癥狀和體征，提高治療效果，因此本研究探索了K56通過(guò)“腸-肺軸”對(duì)小鼠過(guò)敏性哮喘的防治作用及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，為益生菌在過(guò)敏性哮喘臨床防治中的應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

Results and Discussion

K56口服能夠緩解OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠癥狀

使用OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠，將K56干預(yù)分為預(yù)防組（OVA+P-K56）和K56治療組（OVA+T-K56），研究K56對(duì)哮喘的影響。與對(duì)照組相比，OVA組小鼠體質(zhì)量下降，P-K56組和T-K56組均無(wú)法挽救體質(zhì)量下降的情況（圖1A）。霧化過(guò)程中的行為學(xué)評(píng)分結(jié)果表明，隨著霧化時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠抓鼻和哮喘行為的次數(shù)明顯增加，而K56能明顯減輕小鼠在第27、28和29天的行為評(píng)分（圖1B）。同時(shí)，K56預(yù)防性口服能夠有效緩解哮喘小鼠呼吸系統(tǒng)總阻力（Rrs）和氣道彈性阻力（Ers）（圖1C-D），并在12.5 mg/mL濃度時(shí)對(duì)氣道順應(yīng)性（Crs）具有改善作用（圖1E）。肺組織H&E染色病理結(jié)果顯示，口服K56可以顯著改善哮喘小鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺隔膜受損的病理?yè)p傷情況，改善病理炎癥評(píng)分，且預(yù)防性口服的效果優(yōu)于治療性口服。這些結(jié)果表明，口服K56可減輕OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠癥狀并改善肺組織病理?yè)p傷。

圖1 K56口服能夠緩解OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠癥狀

K56預(yù)防性口服能夠顯著減少氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)

考慮到K56對(duì)哮喘小鼠肺組織炎癥浸潤(rùn)的抑制作用，進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)分析了哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的炎癥細(xì)胞表型。結(jié)果顯示，K56有效減少嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞數(shù)量（圖2A-D）。隨后使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定BALF和血清中OVA特異性IgE水平，結(jié)果表明，K56可以顯著降低哮喘小鼠BALF和血清中的OVA特異性IgE含量（圖2E-F）。這些結(jié)果表明，K56能改善哮喘小鼠的氣道炎癥，且預(yù)防效果優(yōu)于治療效果。

圖2 K56預(yù)防性口服能夠顯著減少氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)

K56預(yù)防性口服對(duì)哮喘小鼠肺部CD4+ T細(xì)胞的影響

上述結(jié)果表明預(yù)防性口服的療效更為顯著，因此進(jìn)一步研究預(yù)防性口服K56緩解哮喘的作用機(jī)制。對(duì)肺部的單細(xì)胞懸液CD4+ T細(xì)胞分群進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，哮喘小鼠的總細(xì)胞、Th2、Th17、Treg細(xì)胞明顯增加（圖3A、C-E），而Th1細(xì)胞則明顯減少（圖3B）。與哮喘小鼠相比，K56顯著降低了肺中總細(xì)胞和Th2細(xì)胞的比例，增加了Treg細(xì)胞的比例，并糾正了哮喘小鼠肺部Th17/Treg的失衡（圖3F）。這些結(jié)果表明，預(yù)防性口服K56影響了哮喘小鼠肺部CD4+T細(xì)胞分化。

圖3 K56預(yù)防性口服能夠影響哮喘小鼠肺部CD4+ T細(xì)胞分化

K56預(yù)防性口服對(duì)哮喘小鼠結(jié)腸CD4+T細(xì)胞的影響

考慮到口服K56是一種從健康嬰兒腸道中分離出來(lái)的食品級(jí)益生菌，推測(cè)進(jìn)入腸道的K56會(huì)首先影響腸道CD4+ T細(xì)胞，進(jìn)而影響哮喘小鼠肺部的CD4+ T細(xì)胞。K56預(yù)防性口服可以明顯改善哮喘小鼠結(jié)腸縮短的情況（圖4A），同時(shí)，結(jié)腸粘膜固有層的CD4+ T細(xì)胞群流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，雖然K56對(duì)總細(xì)胞、Th1、Th2和Th17細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有顯著影響（圖4B-E），但卻提高了Treg細(xì)胞的比例（圖4F）。這些結(jié)果表明，K56對(duì)哮喘的緩解作用可能與其能夠促進(jìn)腸道Treg細(xì)胞分化的能力有關(guān)。

圖4 K56預(yù)防性口服能夠影響哮喘小鼠結(jié)腸CD4+ T細(xì)胞分化

K56預(yù)防性口服能夠影響哮喘小鼠腸道微生物群結(jié)構(gòu)

以往有研究表明，腸道微生物群能夠?qū)reg細(xì)胞的分化產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。因此，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠糞便進(jìn)行了16S rRNA基因測(cè)序，以進(jìn)一步研究K56對(duì)腸道微生物群的影響。觀察發(fā)現(xiàn)，K56預(yù)防性口服部分改善了哮喘小鼠腸道內(nèi)較低的微生物群落豐富度（圖5A）。β-多樣性分析進(jìn)一步顯示出不同組間腸道微生物群的顯著分離，基于Bray-Curtis差異的PCoA（對(duì)照組vs. OVA：R2＝0.206，P＝0.038；OVA vs. OVA+K56：R2＝0.087，P＝0.378）分析表明，小鼠的微生物群落結(jié)構(gòu)在OVA誘導(dǎo)后受到很大影，而K56干預(yù)后的群落結(jié)構(gòu)則更接近對(duì)照組小鼠（圖5B）。此外，小鼠腸道微生物群的群落組成在門水平和屬水平上也存在明顯差異（圖5C）。隨后的LEfSe分析結(jié)果顯示，在屬水平上，與對(duì)照組相比，哮喘小鼠顯著富集了Clostridium，而與K56組相比，哮喘模型組顯著富集了Prevotella和Thermus，而K56則顯著富集了Christensenella（圖5D）。

圖5 K56預(yù)防性口服對(duì)哮喘小鼠腸道微生物群結(jié)構(gòu)的影響

隨后對(duì)小鼠腸道內(nèi)具體差異微生物菌屬進(jìn)行分析（圖6）。哮喘小鼠體內(nèi)的Clostridium和Turicibacter相對(duì)豐度明顯升高，而Lactobacillus和Flexispira豐度則有所下降；Bacteroides，Prevotella，Burkholderia，Sutterella和Shigella豐度呈上升趨勢(shì)。K56預(yù)防性口服能夠逆轉(zhuǎn)哮喘小鼠中這些菌屬的增加趨勢(shì)，并可以顯著提高Akkermansia和Burkholderia的豐度。總之，預(yù)防性口服K56能夠明顯改變腸道微生物群的組成結(jié)構(gòu)。

圖6 K56預(yù)防性口服對(duì)哮喘小鼠腸道微生物菌屬的影響

K56預(yù)防性口服能夠影響哮喘小鼠腸道微生物群代謝產(chǎn)物及結(jié)腸SCFA受體的表達(dá)

研究表明，腸道微生物群能夠通過(guò)膳食纖維的厭氧發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs，SCFA可通過(guò)誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化影響免疫平衡。因此接下來(lái)研究了小鼠結(jié)腸內(nèi)容物中的SCFA水平。K56預(yù)防性口服能夠改善哮喘小鼠糞便中丁酸鹽、戊酸鹽、己酸鹽和異戊酸鹽含量的顯著下降（圖7A）。SCFA與不同腸道微生物菌屬之間的相關(guān)性分析表明，K56對(duì)SCFA的影響與許多腸道微生物密切相關(guān)（圖7B），同時(shí)，丁酸鹽與Treg細(xì)胞之間也存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（圖7C）。為了進(jìn)一步研究SCFA如何影響Treg細(xì)胞，檢測(cè)了結(jié)腸SCFA受體FFAR2、FFAR3和PPARγ的mRNA表達(dá)水平并發(fā)現(xiàn)，K56的干預(yù)顯著提高了FFAR3和PPARγ的mRNA表達(dá)（圖7D）。此外，進(jìn)一步的相關(guān)分析還顯示，結(jié)腸中的Treg細(xì)胞與FFAR3呈顯著的正相關(guān)，而與FFAR2和PPARγ則無(wú)顯著相關(guān)性（圖7E）。這些結(jié)果表明，K56可提高SCFAs的水平，隨后激活SCFA受體，如FFAR3，從而參與Treg細(xì)胞的分化。

圖7 K56預(yù)防性口服對(duì)哮喘小鼠腸道代謝物的影響

Conclusion

本研究表明，預(yù)防性口服K56可減輕氣道高反應(yīng)性和炎癥。其作用機(jī)制可能是K56通過(guò)改變腸道微生物群，進(jìn)一步促進(jìn)SCFA受體的表達(dá)和Treg細(xì)胞的分化，最終改善哮喘小鼠的氣道炎癥浸潤(rùn)和氣道高反應(yīng)性，恢復(fù)哮喘患者體內(nèi)穩(wěn)態(tài)（圖8）。

圖8 K56預(yù)防性口服對(duì)哮喘小鼠影響總結(jié)圖

第一作者

崔佳琦，北京中醫(yī)藥大學(xué)在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)檠装Y性疾病的中醫(yī)藥免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

洪雁飛，北京中醫(yī)藥大學(xué)在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)榉文c疾病的中醫(yī)藥免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

通信作者

彭桂英，教授，博士生導(dǎo)師，現(xiàn)任北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院免疫與微生物教研室主任。主要從事炎癥性疾病的機(jī)制及中醫(yī)藥免疫調(diào)節(jié)作用研究。國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目函審專家，世界中聯(lián)過(guò)敏性疾病研究專業(yè)委員會(huì)常務(wù)理事，中國(guó)民族醫(yī)藥學(xué)會(huì)大數(shù)據(jù)人工智能分會(huì)常務(wù)理事，中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)免疫分會(huì)常委，中國(guó)病理生理學(xué)炎癥發(fā)熱感染低溫專業(yè)委員會(huì)委員，中國(guó)免疫學(xué)會(huì)中醫(yī)藥分會(huì)委員。主持國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目4項(xiàng)，參與國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃1項(xiàng)，參與完成多項(xiàng)國(guó)家級(jí)及省部級(jí)課題。在Gut microbes、Food&Function、Journal of leukocyte biology、Nature immunology等專業(yè)雜志發(fā)表論文70余篇，授權(quán)專利3項(xiàng)。

Prophylactic treatment of Lacticaseibacillus paracasei K56 ameliorates asthma by regulating short-chain fatty acid production and Treg differentiation

Jiaqi Cuia,#, Yanfei Honga,#, Wei-Hsien Liub, Wen Zhaob, Xinmei Nana, Xuekai Shanga, Yalan Lia, Haotian Fengb, Qiuyue Jiangb, Wei-Lian Hungb,*, Guiying Penga,*

a Department of Immunology and Microbiology, School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

b Inner Mongolia Yili Industrial Group Co., Ltd., Hohhot 010110, China

# Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Many studies have shown that the development of allergic asthma is associated with intestinal microbiota dysbiosis. Based on the gut-lung axis theory, probiotic intervention may be a potential strategy for respiratory diseases. Lacticaseibacillus paracasei K56 was reported to regulate gut microbiota in mice. However, its effect on allergic asthma has not been reported. In this study, we investigated the effect of the K56 on ovalbumin-induced asthma and its possible mechanisms. Our results showed that K56 reduced asthma symptoms and inflammatory cell infiltration in the lung of asthmatic mice. And K56 regulated the differentiation of helper T cells in the lung and intestine. Results from 16S rRNA gene sequencing showed that K56 prophylaxis significantly elevated the richness of Akkermansia and Burkholderia. Meanwhile, K56 abrogated the decrease in the levels of short-chain fatty acids (SCFAs) in the feces. In addition, a rebound in the mRNA expression of the SCFA receptors was observed after K56 prophylaxis. Notably, the regulatory T cell (Treg) frequencies and the FFAR3 levels were positively correlated. These results suggest that K56 could attenuate asthma, possibly by modulating the intestinal microbiota and regulating Treg differentiation through SCFA metabolized. Our study showed that K56 may be used as a probiotic to prevent pulmonary inflammation and dysbiosis of the intestinal microbiota in allergic asthma.

Reference:

CUI J Q, HONG Y F, LIU W H, et al. Prophylactic treatment of

Lacticaseibacillus paracasei

本文編譯內(nèi)容由作者提供

編輯：梁安琪；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創(chuàng)意